论文部分内容阅读
创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)是指个体经历突发性、威胁性或灾难性生活事件后,使个体延迟出现和长期持续存在的精神障碍。目前,临床上PTSD的症状主要有重现创伤性体验、情感麻痹冷漠、警觉性增高且易激惹、失眠、情绪起伏大等。PTSD不仅导致个体生活质量下降、社会职业功能受损,而且还经常和物质滥用、抑郁障碍、焦虑障碍、恐惧症等共病,给家庭及社会造成长期而持续的负面影响。因此,深入探讨PTSD的发生机制、寻求有效的治疗靶点,对于发展持久有效的预防和治疗措施具有重要的指导意义。p75神经营养素受体(p75 neurotrophic receptor,p75NTR)作为一种低亲和力、多效能的神经营养素受体,在调控细胞凋亡、轴突生长、细胞周期等方面具有重要作用。p75NTR的激活除可促进脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)与酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B,Trk B)高亲和性受体结合介导神经元的再生,还可作为Nogo-66受体(Nogo-66 recptor,Ng R)的协同受体参与神经元突起生长的抑制作用。临床资料显示,p75NTR可通过Caspase-9和pro-BDNF介导神经元的凋亡,导致PTSD患者海马和杏仁核体积减小;另一方面,PTSD患者的创伤性记忆持久存在并易于激活,这种恐惧性记忆可通过p75NTR和pro-BDNF介导突触可塑性的双向调节来实现。因此,p75NTR作为一个新的治疗靶点,可能参与PTSD的病理生理过程。基于以上研究,本实验通过侧脑室注射(Intracerebroventricular injection,ICV)前期我们通过基因工程方法制备的p75NTR胞外域(extracellular domain,ED)与Ig G Fc融合蛋白(p75NTR-ED-Fc)来拮抗内源性p75NTR的活性,并通过行为学鉴定和组织学检测评价治疗效果,同时探讨p75NTR在海马神经元凋亡及突触改变中的作用及分子机制,为筛选治疗PTSD患者的药物提供可靠的新型靶点。主要研究内容:1.动物模型的制备与给药干预将8周龄的雌性SD大鼠随机分为Control组、PTSD+p75NTR-ED-Fc组、PTSD+NS组及PTSD组,采用单一连续刺激(Single-prolonged stress,SPS)法制备PTSD动物模型,对PTSD+p75NTR-ED-Fc组进行给药干预,对PTSD+NS组给予等量的生理盐水。2.行为学鉴定采用旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫实验对实验大鼠进行行为学测定,通过行为学数据比较各组之间的差异,初步评价治疗效果。3.组织形态学研究采用HE染色、NISSL染色及Golgi-cox染色的方法观察各组海马神经元及树突棘的基本结构与形态。4.分子机制研究采用免疫荧光染色的方法检测与神经细胞凋亡相关蛋白如p75NTR、Bcl-2及Caspase-3的表达,检测与神经突触可塑性相关因子如Synapsin I、p CREB及ROCK-2的表达。评价治疗效果的同时,探讨PTSD发生机制。主要结果及结论:1.行为学结果:(1)拒俘反应:PTSD组大鼠拒俘反应性得分显著高于Control组(P<0.01),而PTSD+p75NTR-ED-Fc组拒俘得分显著低于PTSD组(P<0.05)。(2)旷场实验:PTSD组与Control组的梳理次数、站立次数、静止时间均有显著性差异(P<0.01),PTSD+p75NTR-ED-Fc组大鼠在中央区域停留时间显著高于PTSD组(P<0.01)。(3)高架十字迷宫:PTSD+p75NTR-ED-Fc组前往开臂的次数与开臂停留时间均显著高于PTSD组(P<0.01);(4)在水迷宫实验:PTSD组与Control组在定位航行的第2、3、6天第一次寻靶潜伏期无显著性差异,而PTSD组在第1、4、5天潜伏期显著性延长(P<0.01),PTSD+p75NTR-ED-Fc组的与PTSD组在定位航行的第1、4、5天有显著性差异;空间探索实验中,PTSD+p75NTR-ED-Fc组与PTSD组在象限停留时间与穿台次数也有显著性差异。上述结果表明,侧脑室注射p75NTR-ED-Fc能在一定程度上降低攻击行为和逃避行为、增加其活动能力、缓解焦虑状态、增强学习记忆水平,对PTSD大鼠行为学具有一定程度的改善作用。2.组织形态学实验结果:Control组CA3区细胞密集均匀分布,结构清晰,细胞大小均一,CA1区椎体细胞的基树突数目较多,且辐射层中椎体细胞的顶树突干均匀发出侧枝;PTSD组CA3区神经细胞结构不清晰,细胞碎片多,CA1区椎体细胞数目几乎可数,分布稀疏,且只有少数椎体细胞着色;PTSD+p75NTR-ED-Fc组CA3区细胞密集,形态大小无明显差异,结构较清晰,CA1区的辐射层中可见明显的椎体细胞,分布均匀,分支夹角大,DG区可见多个大型苔藓细胞,密集程度明显比PTSD高。表明,p75NTR-ED-Fc对PTSD大鼠的行为学改善作用可能与海马神经元的保护作用及树突棘数目及形态有关。3.分子机制实验结果:TUNEL凋亡检测结果显示,与Control组相比,PTSD组海马凋亡神经元数量显著偏高,且海马体DG区Bcl-2、Synapsin I及p CREB表达水平显著降低,而p75NTR、Caspase-3及ROCK-2表达量则显著上调。而与PTSD组比,PTSD+p75NTR-ED-Fc组海马DG区被TUNEL染色标记的阳性细胞数量显著降低(P<0.01),且Bcl-2、Synapsin I及p CREB的表达量明显上调,而p75NTR、Caspase-3及ROCK-2的表达量则显著下调。提示,p75NTR-ED-Fc对PTSD大鼠的行为学改善作用可能是通过海马神经元的保护作用及突触可塑性调节来实现的。