目的砷及其化合物是国际癌症研究机构(IARC)确认的人类致癌物。长期饮用高砷水可导致砷性皮肤损伤及皮肤癌,并与全身其他多组织器官的肿瘤、心血管疾病、糖尿病及儿童智力损伤的发生有关。目前,全球约有2亿人因长期饮用高砷水而面临健康威胁。然而,高砷暴露人群的砷中毒易感性有所不同。作为一种外来化合物,砷在体内的代谢转化与其毒性的发生发展关系密切。饮用水中的砷主要是无机砷(iAs),iAs在人体内发生以甲基化为主的生物转化,可产生多种具有不同毒性和靶器官的代谢产物。流行病学调查发现,对砷进行二甲基化能力较强或尿中一甲基砷(MMA)相对含量较少的人群患砷暴露相关疾病的风险较低,这提示砷中毒易感性与砷甲基化模式有关。因此,砷甲基化模式的研究对于进一步探索砷中毒的发病机制和预防砷中毒的发生都具有重要意义。氧化应激学说是砷中毒发病机制的重要理论之一。砷甲基化是否会影响机体的氧化应激状态,是否通过对氧化应激状态的影响而导致人群砷中毒易感性差异,尚缺乏相关报道。本研究通过对我国亚急性和慢性饮水型砷暴露人群的调查研究,分析不同特征人群砷甲基化特点,探讨谷胱甘肽硫转移酶ω-1(GSTO1)和谷胱甘肽硫转移酶ω-2(GSTO2)基因多态性对砷甲基化的影响。同时,以人群血抗氧化物和尿DNA氧化损伤标记物反映砷暴露对机体氧化应激状态的影响,并分析机体氧化应激状态与砷甲基化模式和GSTO1、GSTO2基因多态性之间的联系。方法1、研究对象(1)亚急性砷暴露人群:76名研究对象来自2004年12月辽宁省阜新市某铜冶炼厂因排污管破裂污染饮用水[水砷含量为(48.5±43)mg/L]引发亚急性砷中毒事件时,阜新市中心医院收治的患者。(2)慢性高砷暴露人群:研究对象来自内蒙古呼和浩特市周边3个不同饮用水砷浓度的高砷暴露村(乃莫板、口肯板和什力格图)。3村均采用集中供水方式为本村居民提供生活用水,供水水源为各自村中的深井,井水砷浓度分别为0.09mg/L、0.16 mg/L和0.24 mg/L。已知高砷暴露时间分别为7年、7年、6年。参与研究的调查对象为:0.16 mg/L砷暴露组108人,0.09 mg/L砷暴露组100人,0.24 mg/L砷暴露组72人。(3)慢性低砷暴露(对照)人群:来自内蒙古呼和浩特市土默特左旗田家营村,该村亦为集中供水,水砷浓度0.02 mg/L,低于中国农村饮用水砷最高允许浓度0.05 mg/L。2、流行病学调查亚急性与慢性砷暴露比较分析人群:亚急性砷中毒病人资料从阜新市中心医院获得。对与之比较的慢性砷暴露人群采用横断面调查,收集人群饮水方式、饮水量、疾病史等信息。慢性饮水型砷暴露人群砷甲基化模式与氧化应激状态分析研究对象:通过调查问卷获得研究对象的吸烟、饮酒、饮食习惯、饮水方式与每日饮水量、疾病史等信息。由专业医师对调查对象进行体检,并依据《中国砷中毒诊断标准》(WS/T211-2001)进行砷中毒症状检查。3、样品采集(1)尿液样品:采集亚急性砷中毒患者在收治入院未进行治疗时的尿样;采集慢性砷暴露人群的即时尿样。上述样品均放置于0-4℃冰盒中运送回实验室,-80℃保存待测。(2)血液样品:采集人群空腹静脉血5 ml,加入肝素包被的抗凝管,根据不同实验目的现场分装,于液氮中保存运送回实验室,-80℃保存待测。4、尿形态砷分析尿液样品与2mol/LNaOH等体积比混合,于100℃恒温消化3 h,采用冷井捕集-氢化物发生-原子吸收分光光度法测定样品中iAs、MMA、二甲基砷(DMA)和三甲基砷(TMA)含量,并以各形态砷含量之和作为总砷(TAs)含量。以苦味酸法检测尿中的肌酐(Cr)水平以校正尿砷含量。用尿中不同形态砷所占总砷百分比(iAs%、MMA%和DMA%)和2个砷甲基化率指标[一甲基化率(FMR)和二甲基化率(SMR)]反映机体砷甲基化模式。5、基因型分析采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)方法检测GSTO1基因A140D和GSTO2基因N142D的基因多态性。6、全血还原型谷胱甘肽(GSH)含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性测定以5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)法测定全血GSH含量;采用亚硝酸盐形成法测定SOD活性;以氰化物高铁血红蛋白形成法测定血红蛋白水平,对血GSH含量和SOD活性进行校正。7、尿8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平测定采用酶联免疫吸附法测定尿8-OHdG含量,以尿Cr水平对其进行校正。8、统计分析用SPSS 11.0对数据进行统计分析。对自身不服从正态分布并且转化后依然不服从或近似正态分布的数据采用非参数检验:2组间比较采用Mann-Whitney U检验:3组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。对转化后服从或近似正态分布的数据进行参数检验:采用单因素方差分析和LSD法比较2组以上数值变量间是否具有统计学差异;采用t检验比较2组间数值变量是否具有统计学差异。应用多元线性回归模型,分析机体氧化应激状态与砷甲基化能力的联系强度和相关性。结果1、亚急性砷暴露与慢性高砷暴露和慢性低砷暴露(对照)人群砷甲基化模式比较不同类型砷暴露人群中均发现尿形态砷构成比均存在明显的个体差异;尿中各种形态砷和TAs含量在亚急性砷中毒人群中最高,在慢性低砷暴露人群中最低,且各组间差异均具有统计学意义(P＜0.05);尿iAs%和MMA%从高到低为:亚急性砷暴露人群＞慢性高砷暴露人群＞慢性低砷暴露人群;而DMA%、FMR和SMR在3组人群中从高到低为:慢性低砷暴露人群＞慢性高砷暴露人群＞亚急性砷暴露人群。上述指标在各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。2、亚急性与慢性高、低砷暴露人群尿8-OHdG水平比较亚急性砷暴露人群尿8-OHdG水平显著高于慢性高砷和低砷暴露人群(P＜0.05),慢性高砷暴露人群尿8-OHdG水平显著高于慢性低砷暴露人群(P＜0.05)。3、饮用水砷浓度对尿砷和砷甲基化模式的影响尿中各种形态砷与TAs含量比较结果为:0.16 mg/L砷暴露组＞0.09 mg/L砷暴露组＞0.02 mg/L砷暴露组,且各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。0.16 mg/L和0.09 mg/L2个高砷暴露组人群尿iAs%和MMA%均显著高于0.02 mg/L低砷暴露组(P＜0.05),而DMA%、FMR和SMR均显著低于0.02 mg/L砷暴露组(P＜0.05);0.16 mg/L砷暴露组人群仅尿DMA%和SMR显著高于0.09 mg/L砷暴露组(P＜0.05)。4、儿童与成人尿砷含量与砷甲基化模式的比较0.16 mg/L和0.09 mg/L2个高砷暴露组儿童尿TAs含量与同组成人相比均无统计学差异(P＞0.05),儿章尿MMA%均显著低于同组成人(P＜0.05),而DMA%和SMR均显著高于同组成人(P＜0.05)。0.02 mg/L低砷暴露组儿童尿TAs含量显著高于成人(P＜0.05),尿形态砷构成比和砷甲基化率与成人相比无统计学意义(P＞0.05)。5、男性与女性尿砷含量与砷甲基化模式的比较同一砷浓度暴露条件下,未见男性与女性在尿形态砷含量和砷甲基化模式上存在统计学差异(P＞0.05)。6、砷暴露时间对尿砷含量和砷甲基化模式的影响0.16 mg/L砷暴露组25名儿童和39名成人在砷暴露7年和9年尿TAs含量均无显著差异(P＞0.05)。儿章与成人砷暴露9年时尿iAs%和MMA%均显著高于砷暴露7年(P＜0.05),而DMA%、FMR和SMR均显著低于砷暴露7年(P＜0.05)。砷暴露7年时,尿iAs%具有显著差异(P＜0.05)的3组人群在砷暴露9年时尿iAs%差异无统计学意义;砷暴露2年前后,机体相对砷甲基化模式发生改变。7、砷甲基化模式的家庭相关性各形态砷百分比和2次砷甲基化率在兄弟姐妹和父母子女间均呈现显著相关性(P＜0.05),在夫妻间未发现上述指标具有显著相关性。8、GSTO1基因A140D和GSTO2基因N142D基因多态性与砷甲基化模式的关系同一砷暴露组内,GSTO1基因A140D或GSTO2基因N142D基因型不同的人群在尿形态砷含量及砷甲基化能力上均无统计学差异(P＞0.05)。9、砷暴露对血GSH含量和SOD活性的影响0.16 mg/L砷暴露组儿童与成人血GSH含量均显著低于0.09mg/L和0.02 mg/L砷暴露组儿童与成人(P＜0.05),0.09mg/L与0.02 mg/L砷暴露组儿童和成人血GSH差异无统计学意义(P＞0.05);同一砷暴露组内,仅0.09 mg/L砷暴露儿童与成人血GSH含量差异具有统计学意义(儿章＞成人,P＜0.05)。0.1 6 mg/L砷暴露组儿童与成人血SOD活性均显著低于0.09 mg/L砷暴露组(P＜0.05),0.09 mg/L砷暴露组儿童和成人SOD活性均高于0.02 mg/L砷暴露组(P值分别为＜0.05和=0.074)。同一砷暴露组内儿童与成人血SOD活性无显著统计学差异(P＞0.05)。10、砷暴露对人群尿8-OHdG水平的影响不同砷浓度暴露组成人尿8-OHdG水平比较:0.1 6 mg/L砷暴露组＞0.09 mg/L砷暴露组＞0.02 mg/L砷暴露组,且各组间差异具有统计学意义(P＜0.05);0.16mg/L和0.09 mg/L砷暴露组间儿童尿8-OHdG水平无显著差异,但均显著高于0.02mg/L砷暴露组(P＜0.05)。高砷暴露9年时,儿章与成人尿8-OHdG水平均显著高于砷暴露7年(P＜0.05)。11、砷甲基化模式与GSH、SOD和8-OHdG的相关性儿章与成人尿8-OHdG水平均与iAs%、MMA%呈显著正相关,与尿DMA%、FMR和SMR呈显著负相关;儿童与成人全血GSH均与iAs%、MMA%呈显著负相关,儿章全血GSH含量与FMR呈显著正相关,成人全血GSH含量与尿DMA%、FMR和SMR呈显著正相关;仅在成人中观察到血SOD活力与尿iAs%和MMA%呈显著负相关,与尿DMA%、FMR和SMR呈显著正相关。12、GSTO1基因A140D和GSTO2基因N142D基因多态性与机体氧化应激状态的关系同一砷暴露组内,GSTO1基因A140D或GSTO2基因N142D基因型不同的人群在血GSH含量、SOD活力和尿8-OHdG水平上均无统计学差异(P＞0.05)。结论1、人体的砷甲基化能力随砷暴露剂量率升高或暴露时间延长而降低;同样砷浓度暴露水平下,砷甲基化模式无显著性别差异,儿童的砷甲基化能力高于成人,机体的砷甲基化模式与GSTO1 A140D或GSTO2 N142D的基因多态性无关。除遗传因素外,外源性因素对砷甲基化模式的影响不容忽视。2、高砷暴露可使人体抗氧化能力下降,DNA氧化损伤加重,且砷所致DNA氧化损伤可随砷暴露剂量率的升高或暴露时间的延长而加重。3、砷暴露人群的氧化应激状态与砷甲基化模式关系密切,这可能是砷甲基化模式多样性影响砷中毒易感性的重要原因。