【摘 要】
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目的:假体周围骨溶解（PPO）是全关节置换术最常见的并发症,常导致假体植入失败和翻修手术。已有研究表明,假体表面磨损颗粒引起的破骨细胞异常形成和骨丢失是PPO的主要致病原因。Hedgehog（Hh）信号通路已被证明在成骨分化过程中发挥重要作用,但Hh信号通路激活对破骨细胞分化的直接作用目前仍存在争议。本文旨在研究Hh信号通路调控破骨细胞分化的作用及分子机制,并进一步探究其在预防磨损颗粒诱导的骨溶解
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目的:假体周围骨溶解（PPO）是全关节置换术最常见的并发症,常导致假体植入失败和翻修手术。已有研究表明,假体表面磨损颗粒引起的破骨细胞异常形成和骨丢失是PPO的主要致病原因。Hedgehog（Hh）信号通路已被证明在成骨分化过程中发挥重要作用,但Hh信号通路激活对破骨细胞分化的直接作用目前仍存在争议。本文旨在研究Hh信号通路调控破骨细胞分化的作用及分子机制,并进一步探究其在预防磨损颗粒诱导的骨溶解中的治疗潜力。方法:（1）在0到32 μM的区间内设置浓度梯度,通过CCK-8实验评估不同浓度Purmorphamine（PM）处理48、72、96 h后对BMMs增殖的影响;（2）用非毒性浓度（0、0.5、1、2 μM）的PM处理BMMs 2天,通过qPCR检测Hh信号通路靶基因Gli1的mRNA表达水平;（3）用非毒性浓度（0、0.5、1、2 μM）的PM处理经50 ng/mL RANKL诱导的BMMs 6天,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、F-肌动蛋白环（F-actinring）染色和骨吸收实验,评估Hh信号通路激活对破骨细胞分化的影响;（4）用非毒性浓度（0、0.5、1、2μM）的PM处理经50ng/mL RANKL诱导的BMMs 6天,利用qPCR检测Hh信号通路激活对破骨细胞特异性基因Nfatc1、c-Fos、Acp5、Oscar、Ctsk、Dcstamp、Atp6v0a3、Atp6v0d2 mRNA 表达水平的影响;（5）用2μM PM及等量溶剂处理经50 ng/mL RANKL诱导的BMMs,收集0、1、3天的蛋白,通过Western Blot评估Hh信号通路激活对破骨分化关键转录因子NFATc1、c-Fos蛋白表达水平的影响;（6）用2 μM PM及等量溶剂预处理BMMs4h,用50 ng/mLRANKL刺激0、5、15、30、60min后收蛋白,通过Western Blot评估Hh信号通路激活对NF-κB/P13K-AKT/MAPKs信号通路的影响;（7）建立Ti颗粒诱导小鼠颅骨骨溶解模型,通过Micro-CT、H＆E染色和TRAP染色评估PM的体内治疗效果。结果:（1）2 μM及以下的PM浓度处理96 h对BMMs增殖无明显影响;（2）qPCR结果显示PM处理后剂量依赖性地诱导Gli1的转录,表明PM在BMMs中激活Hh信号;（3）TRAP染色显示,TRAP+多核破骨细胞的数量和大小均显著减少,且呈剂量依赖性。F-actin ring染色显示F-肌动蛋白环的数量和大小均呈剂量依赖性减少,且在2μM PM处理的细胞中,F-肌动蛋白环的形成几乎完全被破坏。在骨吸收实验中,PM以剂量依赖的方式减少骨吸收坑的形成;（4）破骨细胞特异性基因Nfatc1、c-Fos、Acp5、Oscar、Ctsk、Dcstamp、Atp6v0a3、Atp6v0d2 经 PM 处理后均显著下调在mRNA水平的表达,且呈剂量依赖性;（5）Western Blot结果显示,经2μM PM处理后,NFATc1和c-Fos在破骨分化过程中的蛋白表达水平受到明显抑制;（6）RANKL刺激能显著增加p65和AKT的磷酸化水平,而PM处理对p65和AKT的磷酸化水平均无显著影响,且RANKL诱导的p65核易位在经PM处理的BMMs中没有显著改变。PM在经RANKL处理后5和15 min显著降低了 JNK的磷酸化水平而不影响p38和ERK的磷酸化水平,提示Hh信号可能特异性地抑制RANKL诱导的JNK通路的激活;（7）Ti颗粒在对照处理的小鼠颅骨中引起大量骨丢失,而PM治疗可以以剂量依赖的方式有效减轻这种破坏。结论:Hh信号通过负向调控JNK/c-Fos-NFATc1信号级联,在体外直接抑制RANKL介导的破骨细胞的形成,且显著减少了 Ti颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型中破骨细胞的形成和骨破坏。
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