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寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)属黄病毒科黄病毒属,单股正链RNA病毒,直径约50 nm,基因组大小约为10.7Kb。寨卡病毒病是由寨卡病毒引起的一种蚊媒病毒病,主要通过伊蚊进行传播。2015年以后,拉丁美洲寨卡病毒病暴发,同时伴随大量新生儿出现小头症。2016年2月1日,世界卫生组织(WHO)将其列为值得全球关注的公共卫生危机。目前,国内外尚无有效的疫苗和药物可以预防和治疗寨卡病毒病,所以迫切需要研发寨卡病毒疫苗。减毒活疫苗是目前使用的疫苗类型之一,它可以全面激活体液和细胞免疫应答反应,使机体获得更广泛持久的免疫保护。近年来,microRNA(miRNA)介导的靶向减毒策略在病毒疫苗研究领域中取得了突破性进展,其主要机制是利用组织细胞内特异的miRNA能够控制病毒组织嗜性,借此降低或消除病毒在特定组织的增殖和致病效应。这一策略能保留病毒免疫原性,又可降低病毒致病性,为研制新型减毒活疫苗提供了全新的手段。现已确认,寨卡病毒感染能够导致胚胎脑中神经干细胞的增殖与分化异常,造成神经元大量死亡,引起小头症。因此,如果能够抑制寨卡病毒在胚胎脑组织中的复制,则有可能大大降低寨卡病毒感染导致小头症的发生风险。本研究中,首先通过反向遗传学技术构建携带有脑组织特异miRNA靶序列的寨卡病毒全长感染性cDNA克隆;然后拯救携带有miRNA靶序列的寨卡重组病毒并鉴定生物学特征;最后在动物模型上评价该重组病毒的免疫原性和保护效果,为下一步寨卡病毒减毒活体疫苗的研制奠定基础。一、寨卡病毒microRNA靶向减毒疫苗株的构建与鉴定基于特异性miRNA在相关组织器官中的作用原理作为减毒机制,对寨卡减毒株的构建进行了合理设计。将脑组织特异性的mi RT-9、miRT-124和miRT-125靶序列的单拷贝和三拷贝分别插入寨卡病毒基因组的3’URT序列前端10379bp处,利用反向遗传学技术拯救重组病毒。拯救的重组病毒进一步通过蚀斑、生长曲线、IFA、结构预测、遗传稳定性、RNA mimics体外干扰及动物实验等方法对其生物学特征进行鉴定。结果表明:重组病毒蚀斑略小于亲本株,能够在BHK-21、C6/36、Vero细胞系中高效复制,并且能够高效表达病毒特异E蛋白;结构预测和序列分析发现,除miRT-125*3重组病毒株二级结构不稳定,并且其第6代序列发生突变外,其余5株均结构稳定,能够稳定遗传;RNA mimics体外干扰能够抑制miRT-124*3重组病毒株复制能力,同时重组病毒在小鼠脑组织中的复制受限,这说明miRNA的确能够调控重组病毒增殖;更重要的是,重组病毒的乳鼠神经毒力只为亲本株的1/10,毒力显著降低。二、寨卡病毒microRNA靶向减毒疫苗株的免疫原性与保护评价根据第一部分实验结果,我们在6种重组病毒中选择了神经毒力较弱的miRT-124*3减毒株,利用建立的小鼠和孕鼠保护模型进一步评价其免疫原性和免疫保护效果。实验结果表明,免疫成鼠后miRT-124*3重组病毒株能够诱导小鼠产生较高的中和抗体,显著降低产生的病毒血症,具有较好的免疫原性;免疫母鼠后,能够对母鼠起到完全保护,无病毒血症现象出现,同时,在胎盘和胎头中也检测不到病毒,能够保护胚胎发育。这说明miRT-124*3重组病毒株不仅可以有效保护成鼠,而且可以保护孕鼠和胎鼠。综上,本研究以寨卡病毒株的感染性克隆为骨架,通过反向遗传学技术成功构建并获得携带有脑组织特异性miRNA靶序列的寨卡重组株。该重组病毒能够在体外细胞水平稳定复制,并在小鼠动物模型上充分表现出了明显的减毒特征,同时该病毒具有较好的免疫原性,能够对免疫小鼠和孕鼠起到较好的保护作用。