新的肝细胞生长因子-HPPCn的分离纯化及其生物学活性的研究

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我国是一个肝病大国,随着科技经济的飞速发展,人们的生活节奏加快,人们的健康也频频亮起红灯,肝炎、肝硬化与肝癌的发病率越来越高,对社会危害严重。因而深入研究肝损伤与再生的分子生物学机制,开发治疗肝病新药,意义重大。新的肝细胞生长因子HPPCn就是在此背景下诞生的一种具有特异性的促肝癌细胞系增殖活性的单体。本研究的主要目的是对HPPCn重组表达产物进行纯化并对纯化产物进行体内功能学研究。根据HPPCn的分子量、等电点等特性,采用两步阴离子交换层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,HPLC和凝胶扫描分析其纯度,Western blot法分析其免疫原性,MALDI-TOF测定其分子量。结果,采用两步阴离子交换层析纯化的蛋白纯度达94%,纯化总得率为8.5%,蛋白总量和纯度均达体内外活性研究的要求。采用MTT法和3H-TdR DNA掺入法检测纯化的HPPCn对肝癌细胞系SMMC 7721的促增殖活性及其剂量关系:通过鼠肝原位灌流法分离培养大鼠原代肝细胞,3H-TdR DNA掺入法检测HPPCn对原代培养大鼠肝细胞的促增殖作用,进一步验证HPPCn的体外促肝细胞增殖活性。结果表明,纯化HPPCn能显著促进SMMC772l和原代培养大鼠肝细胞的增殖并有一定的剂量依赖性。体内活性研究中,首先采用经典的部分肝切除模型,检测残肝中HPPCn表达量的时间动态变化,结果表明HPPCn与肝再生密切相关;建立CC14和ConA致小鼠急性肝损伤模型以及CC14复合造模法制备大鼠肝纤维化模型,检测血清生化指标变化及肝脏病理观察等指标,结果表明,HPPCn对急慢性肝损伤有显著治疗和修复作用。在这些模型中均发现了一个现象:给药组出血比生理盐水对照组严重,因此又建立了促进血管生成实验模型——鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,结果表明,HPPCn的促血管生成作用没有显著性差异。
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