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非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种无过量酒精摄入,而以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。其病理类型包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）以及NASH相关肝硬化,后者可发展为肝癌。NAFLD常常与肥胖、2型糖尿病、高血压、血脂紊乱等代谢综合征（metabolic syndrome,MS）紧密相关。由于生活方式的转变,饮食结构中高脂肪的摄入等原因,NAFLD在全球分布广泛,是临床常见且高发的疾病,在我国的发病率也逐年迅速升高,是继病毒性肝炎后第二位的常见肝病。NAFLD的自然病程尚未完全清楚,发病机制目前尚不能以单一的机制解释。Day和James提出的“二次打击”学说认为各种原因引起的肝细胞脂肪积聚和脂肪变性形成“初次打击”,使肝细胞对炎症反应的各种损伤因素的易感性增高,而细胞内脂质过氧化和氧化应激、炎症性细胞因子的释放等因素形成“二次打击”,诱导了肝脏炎症反应、肝细胞变性坏死和肝纤维化/肝硬化的发生。脂代谢异常是NAFLD发生的基础条件,各种细胞内信号转导途径的改变会造成不同的临床转归。细胞功能障碍等病理情况下的应激涉及线粒体、内质网、细胞核等细胞器,它们既相对独立又联系紧密。内质网是细胞折叠包装蛋白并修饰转运的主要场所,同时也是细胞的Ca2+库,对应激极为敏感,在蛋白合成及其功能正确发挥、Ca2+运输、信号转导中占据核心功能地位;线粒体是脂肪酸β氧化的主要区域,所有氧化还原反应基本上都发生于此细胞器,它也是调节细胞代谢途径,改变细胞生理的关键细胞器。内质网和线粒体结构和功能上的联系对维持细胞内环境自稳态具有重要意义。当细胞出现内质网内部平衡状态的打破称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）,发生内质网应激所激活的细胞内信号通路的改变会对细胞造成生理的或者病理的改变,内质网变化诱发线粒体功能的改变对决定细胞命运是至关重要的。近年来对于内质网应激信号通路及其效应在代谢综合征中的研究十分广泛,因此,我们认为做为一种代谢综合征在肝脏中集中表现的NAFLD可能与内质网存在重要联系。所以,此次研究紧紧围绕内质网应激及脂代谢在NAFLD中的角色和意义开展,以期为阐明其发病机制和为指导临床诊疗提供有价值的线索。主要的研究内容和结果如下:研究内容和方法:正常培养的肝细胞L-02,采用油酸诱导其发生脂肪变性,制作NAFLD的细胞模型。采用油酸诱导0 h、24 h、48 h、72 h NAFLD模型组进行试验分别模拟脂肪变不同程度模型。①油红O染色观察细胞脂肪变程度;②NAFLD细胞模型中定量RT-PCR检测ERS激活的各条信号通路标志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA的表达变化;③Western-Blot检测GRP78、ATF4、SREBP-1c蛋白表达水平的变化;④构建3个SREBP-1c真核表达干扰质粒,转染L-02细胞,筛选高干扰效率质粒;⑤在NAFLD细胞模型中转染干扰质粒,沉默SREBP-1c的表达,检测CCL2和FGF21基因mRNA的表达水平;⑥在NAFLD细胞模型中沉默SREBP-1c表达后,Western-Blot分析CCL2和FGF21蛋白表达的变化。研究结果:1.油酸诱导L-02肝细胞脂肪变性,通过油红O染色观察到脂肪变细胞橘色脂肪滴,细胞形态呈不规则多形态,细胞内脂肪滴的数量和大小与细胞油酸诱导培养时间长短和脂肪变程度保持一致。2.细胞NAFLD模型中,定量分析ERS三条通路的标志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA水平,结果显示:油酸诱导24 h后,GRP78表达量迅速升高（P<0.05）;48 h时表达水平显著升高（P<0.01）并且高水平表达一直持续到72 h。ATF4在24 h后开始缓慢升高,但是在48 h后表达水平显著上升,达到峰值后呈缓慢下降趋势。SREBP-1c从24 h开始一直持续高水平表达。3.细胞NAFLD模型中,ERS三条通路的标志物GRP78、ATF4、SREBP-1c蛋白质表达水平随细胞脂肪变程度不同而各异。GRP78蛋白从肝细胞诱导脂肪变24 h开始,蛋白表达量明显增加,并随着时间延长维持在高表达水平。而ATF4蛋白表达水平迅速升高后有缓慢下降的趋势。SREBP-1c蛋白的表达量开始时呈缓慢增加态势,48 h后急剧增加,而72 h时则有所降低。4.共设计了3条RNA干扰序列,构建了3个相应的RNA干扰真核表达质粒,转染细胞L-02肝细胞,经筛选得到一个高干扰效率的质粒pSilencer-1.0-U6-4476。5.在NAFLD细胞模型中转染pSilencer-1.0-U6-4476质粒沉默SREBP-1c基因表达后,定量分析CCL2基因和FGF21基因的mRNA表达,发现与NAFLD模型组相比, CCL2基因的mRNA水平在干扰质粒转染后24 h开始,表达水平显著降低（P<0.01）。而FGF21基因的mRNA表达在干扰质粒转染24 h后,其变化趋势跟CCL2基因基本一致,也呈明显下调表达趋势,此种差异也是极为显著（P<0.01）的。6.在NAFLD细胞模型中沉默SREBP-1c基因的表达后,与NAFLD模型组相比,CCL2蛋白表达量明显降低,72 h时基本检测不到CCL2蛋白的表达,说明干扰SREBP-1c表达后,细胞脂肪变模型中炎症变化减轻。同样的实验组设置中,FGF21蛋白表达水平显著下降,说明干扰SREBP-1c表达后,细胞内甘油三酯积累减少,脂肪变程度得到缓解。结论:1.油酸诱导L-02肝细胞发生脂肪变性,脂质在细胞内过度积聚,检测分析发现内质网三条信号通路标志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA和蛋白质水平都呈现高表达态势,说明在NAFLD细胞模型中内质网发生了应激,提示ERS可能参与了NAFLD的形成和发展过程;2.在NAFLD模型中ERS发生有不同时序性,不论从mRNA水平还是蛋白表达,GRP78可能是ERS变化的早期分子。而ATF4和SREBP-1c变化规律则不相同。3.在NAFLD细胞模型中沉默SREBP-1c基因的表达,CCL2和FGF21基因的mRNA和蛋白质表达水平均表现为低水平并逐渐下调表达,说明SREBP-1c下调表达可能缓解了内质网应激所致的后续效应,改善了脂代谢的紊乱,从而引起细胞系统性炎症反应减轻,改善了肝细胞生理状态,提示SREBP-1c可能成为临床NAFLD治疗的候选靶点。