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β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）能通过催化β-1,4-甘露糖苷键,将甘露聚糖水解为甘露糖和甘露低聚糖。作为一种重要的工业用酶制剂,β-甘露聚糖酶被广泛应用于动物饲料、食品加工、生物漂白、纺织、可再生能源等领域。由于一些应用领域在加工过程中需要进行高温处理,如饲料制粒、可再生能源生产等,这就要求所开发的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高温性能方面往往达不到要求,因此,开发一种具有优良耐高温能力的β-甘露聚糖酶就显得非常迫切,具有良好的应用前景。在本研究中,我们从热泉中（水温高于68℃）分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的嗜热枯草芽孢杆菌（TBS2）。以TBS2为出发菌株,经过基因克隆,在毕赤酵母X33中进行表达,获得了一种重组耐高温β-甘露聚糖酶（ReTMan26）。采用纯化后的ReTMan26,完成了该酶的相关酶学性质检测并对其耐高温机理进行了相应分析。在此基础上,通过密码子优化,大幅提高了ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平。此外,还确定了来源于生物柴油生产过程中产生的副产物粗甘油可以作为一种廉价碳源,用于毕赤酵母进行ReTMan26的发酵生产。主要研究结果如下:（1）从热泉中分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的细菌,通过形态观察、生理生化培养特征、16S rDNA序列比对及构建系统发育树,鉴定出该细菌为一种嗜热枯草芽孢杆菌（TBS2）。该菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃条件下生长,最适生长pH为6.0-7.0、最适生长温度为50℃。TBS2所产的β-甘露聚糖酶（BS-Man）的最适反应pH为6.0,最适反应温度为55℃,在90℃、水溶液状态下处理10 min,剩余酶活达到63.6%。（2）通过从NCBI中查找出其它来源于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶保守序列,设计引物,成功克隆出来源于嗜热枯草芽孢杆菌TBS2中的耐高温β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列长957 bp,编码318个氨基酸。通过蛋白结构及基因序列分析,该β-甘露聚糖酶属于第26糖苷水解酶家族,含有3个潜在的N-糖基化位点（N8、N26与N255）及2个半胱氨酸位点（C48、C68）。在此基础上,采用克隆出的基因TBS2-Man,构建并筛选出了一株产重组耐高温β-甘露聚糖酶（ReTMan26）的毕赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,该菌株在摇瓶中的发酵水平为312 U×mL-1,在50 L罐中通过高密度液体发酵的表达水平为5435 U×m L-1。（3）对重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33表达的ReTMan26纯化后进行酶学性质检测,结果表明:该酶的最适pH为6.0,在pH 2.0-8.0范围内稳定;最适反应温度为60℃,有效作用温度范围为20-100℃,且在100℃、水溶液条件下处理10 min后,剩余酶活仍然可以达到58.6%;10 mmol×L-1的Mg2+、Mn2+对ReTMan26活性具有促进作用,而Ag+、Hg2+及SDS对ReTMan26具有较强的抑制作用;ReTMan26的Vmax为1612 U×mg-1蛋白,Km值为4.35 mg×mL-1。此外,ReTMan26表现出较强的抗蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）的消化能力。以上酶学性质表明,除其它潜在工业应用外,ReTMan26适宜作为一种饲料酶进行应用。（4）为探究ReTMan26的耐高温机理,对该酶进行了氨基酸序列比对及蛋白质三维结构分析。结果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位点不同、二硫键及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有优良耐高温性能的根本原因。为进一步确定N-糖基化及二硫键对ReTMan26的稳定性,尤其是耐高温性能的影响,分别采用天然蛋白去糖基化试剂盒及定点突变的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖链及2个半胱氨酸位点（C48、C68）。研究发现,N-糖基化可提高ReTMan26的最适反应温度、耐热性能分别为5℃和7℃。此外,N-糖基化还可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分别为23.7%及25.6%。二硫键对ReTMan26的最适反应温度及提高抗消化酶性能没有影响,但可提高耐热性能约3℃。（5）为进一步提高ReTMan26在毕赤酵母X33中的表达水平,对来自于TBS2中的原始ReTMan26编码基因TBS2-Man（Orig）进行了密码子优化,并构建出了一株含优化基因（CoOp）的新重组毕赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生产菌株。该菌株在高密度液体发酵中,ReTMan26的表达水平为10750 U×m L-1,在相同条件下,其生产性能比原重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL-1)提高了98.6%。另外,在经过密码子优化的基因（CoOp）基础上,继续对该基因上游的信号肽（α-factor）进行了Kozak序列（GCCACCATG）改造,实验结果表明,该方法对提高ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平没有效果,但这对今后构建毕赤酵母重组工程菌表达系统,具有一定的参考作用。（6）为降低ReTMan26的生产成本,充分利用废弃资源,采用来源于生物柴油生产的副产物粗甘油作为毕赤酵母快速生长期间的唯一碳源,结果表明:粗甘油中的皂类物质在添加浓度低于0.3%（相对于发酵培养基的质量体积比）时,不会抑制高密度液体发酵时的毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产。在此基础上,不经任何前处理的粗甘油,可替代纯甘油用于ReTMan26的发酵生产。通过采用粗甘油替代纯甘油,ReTMan26的全部发酵生产成本可降低约4.2%。