研究背景宫颈癌是女性最常见的癌症之一,发病率较高。随着近年来宫颈癌筛查的普及,宫颈癌的早期检出率大大增加,死亡率相对减少,但对于晚期复发及放化疗抵抗患者来说其预后仍未改善,不少学者认为其与肿瘤干细胞密切相关。结合本课题组前期研究发现,流式分选出的宫颈癌侧群细胞（SP细胞）增殖、侵袭、放化疗抵抗性等能力较宫颈癌非侧群细胞（NSP细胞）显著增强,且具有类似干细胞的特性。且本课题组前期研究发现,分泌性卷曲蛋白SFRP1在宫颈癌SP及NSP细胞胞外上清液中表达具有统计学差异,且研究发现SFRP1介导的WNT通路是肿瘤干细胞的一种调控通路。因此探讨SFRP1含量差异出现的原因对于了解宫颈癌SP细胞保持干性的研究具有重要意义。同时结合前期单细胞转录组学研究发现,调控蛋白外分泌的RAB27B在宫颈癌SP细胞中显著高表达。因此,研究RAB27B、SFRP1在宫颈癌SP细胞中的作用,有利于为晚期复发及放化疗抵抗患者提供更加有效的治疗手段。研究目的1.明确RAB27B、SFRP1在宫颈癌SP细胞中的相关性及探讨其维持宫颈癌SP细胞保持干性的机制。2.研究SFRP1是否为宫颈癌SP细胞及宫颈癌NSP细胞的功能差异的调控因子。研究方法1.通过外泌体抑制剂刺激宫颈癌SP细胞检测药物刺激前后细胞增殖、迁移及平板克隆能力的变化;通过WB及PCR实验检测与干细胞相关的CD133、Nanog、β-catenin等表达情况,并检测RAB27B的蛋白及mRNA表达情况。2.通过免疫组化实验检测RAB27B在宫颈癌组织中的表达情况;使用si-RAB27B转染宫颈癌SP细胞并检测基因敲除前后细胞增殖、迁移及平板克隆能力变化;使用WB及PCR检测敲除RAB27B前后相关基因表达情况;通过免疫荧光实验检测RAB27B及SFRP1在SP细胞中共定位情况;通过ELISA实验检测敲除RAB27B后SFRP1的外分泌量变化情况。3.SFRP1重组蛋白及抑制剂刺激宫颈癌细胞检测刺激前后细胞增殖、迁移、侵袭及化疗抵抗性变化;WB检测药物处理前后相关目的基因蛋白变化情况。研究结果1.经过外泌体抑制剂刺激24小时后的宫颈癌SP细胞增殖、侵袭及平板克隆能力明显增强;与宫颈癌干细胞相关的CD133、Nanog、β-catenin等蛋白及RNA表达明显增加;外泌体抑制剂刺激后RAB27B蛋白及mRNA表达量亦明显增加。2.免疫组化实验发现RAB27B在宫颈癌SP细胞的细胞核及细胞质中均有表达,主要集中在细胞核;免疫荧光实验发现RAB27B、SFRP1主要在细胞核中表达;经过si-RAB27B片段瞬转后发现,细胞的增殖、侵袭能力、平板克隆能力明显下降;蛋白免疫印迹及PCR实验发现RAB27B敲除后RAB27B及SFRP1表达量明显下降,且胞外分泌SFRP1的量亦明显减少。3.经过SFRP1重组蛋白处理后细胞增殖、侵袭及化疗抵抗性明显增加,且SP细胞增加作用明显强于NSP细胞;SFRP1、β-catenin、c-myc等蛋白显著增加;而SFRP1抑制剂处理后结果相反。研究结论1.RAB27B可以促进宫颈癌SP细胞中SFRP1的表达,并且导致SFRP1胞外分泌量增加。2.SFRP1促进宫颈癌SP细胞增殖、侵袭及化疗抵抗性增加,并可能通过Wnt/β-catenin通路发挥作用。