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脑中风是当今第三大死亡原因及首位致残原因，脑中风后的继发性神经元死亡是由于脑组织缺血缺氧所致，而目前对缺血性脑损伤的机制仍未阐明，临床也无理想的治疗手段。L-型电压敏感性钙通道在海马锥体神经元的树突和胞体都特别集中，通过L-型钙通道的电流占细胞总体钙电流的30-50％。研究发现在培养的海马神经元上，给予L-型钙通道特异性阻断剂可直接诱导神经元死亡，而给予激动剂Bay K 8644则可以对神经元起到保护作用。此外，L-型钙通道能将钙调信号直接传至细胞核，激活核内的信号转导途径，调节某些基因的表达，如c-Fos，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和Bcl-2等，而这些基因对神经元的功能和存活都具有重要意义。上述结果都说明，L-型钙通道功能改变可能在脑缺血后海马神经元死亡过程中发挥了重要的作用，然而其参与缺血性神经细胞死亡的机制目前仍不清楚。L-型钙通道介导钙离子内流，引起胞内钙信号的变化从而调节细胞功能和活动，但其作为电信号和化学信号的整合蛋白，直接的蛋白-蛋白相互作用也可能对通道活性及细胞功能产生影响，而目前对此研究不多，尤其是在细胞信号转导过程中其下游分子及信号转导通路尚不清楚。目前已经报道有许多蛋白激酶和磷酸酶可以直接作用于L-型钙通道，如蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1）、酪氨酸激酶Src等。钙调蛋白（calmodulin，CaM）与Ca2+结合蛋白CABP1（calcium binding protein 1）也可以竞争性的与L-型钙通道α1C亚基C末端相结合。此外，PDZ[postsynaptic density-95（PSD-95）／Discs large／zona occludens-1（ZO-1）]蛋白shank、NIL-16（neuronal interleukin-16）以及其它一些蛋白，如突触蛋白RIM（rab interacting molecular）、可溶性耐药相关钙结合蛋白sorcin、endophilin等也被发现可以与L-型钙通道直接相互作用，影响突触传递及调节通道间联系等。但目前尚未有关于L-型钙通道相互作用蛋白参与神经细胞死亡过程的报道。因此，本实验利用L-型钙通道α1C亚基的C末端为诱饵，通过GST-pull down的方法研究与L-型钙通道相互作用蛋白在大鼠前脑缺血前后的变化，试图寻找缺血性神经细胞死亡中L-型钙通道可能的下游信号分子及转导通路。首先，我们根据GenBank登录的α1C基因的编码核苷酸序列，设计合成针对其C末端（1808-2139）编码序列的一对特异性引物，从pcDNA3／α1C质粒上PCR扩增出其C末端基因，插入谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合表达载体pGEX-KG中，构建了含L-型钙通道α1C亚基C末端编码序列的pGEX-KG／α1C融合蛋白表达载体，经BamHI和HindⅢ双酶切后可见约1，000 bp、5，000 bp大小的两个片段，与预期结果一致，测序结果表明序列正确。然后，在原核细胞E.coli BL21中诱导GST融合蛋白的表达，在异丙基-β-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）的诱导下，重组菌表达出一个分子量约为70 KD的表达产物，Western-blot结果证实，重组GST融合蛋白可与抗GST抗体及针对α1C亚基C末端的抗体发生特异性的反应，表明表达的蛋白为预期的融合蛋白。利用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化GST-α1C重组蛋白，并进行SDS-PAGE分析，重组质粒分别在70 KD、40 KD、30 KD左右出现三条蛋白条带，用抗α1C一抗，羊抗兔为二抗，进行Western blot验证，三条带均呈阳性，可能GST-α1C融合蛋白在纯化过程中发生了降解。最后，采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制做大鼠全脑缺血模型，在缺血再灌流24小时后，提取海马组织蛋白分别与纯化后固定于谷胱苷肽琼脂糖珠的GST-α1C、GST蛋白共同孵育，洗脱后经SDS-PAGE分析，发现缺血组与假手术组相比可见三条差异条带。其中两条在缺血后与L-型钙通道结合减少，一条与L-型钙通道结合增加，说明在大鼠海马组织中存在与α1C亚基C末端片断相互作用的蛋白，且部分与L-型钙通道结合的蛋白在缺血过程中发生了变化，因此，这些发生变化的蛋白与L-型钙通道的相互作用很可能在缺血性神经细胞死亡过程中发挥了重要的作用。综上所述，我们成功构建了质粒pGEX-KG／α1C，纯化得到GST-α1C融合蛋白，并利用GST-pull down的方法观察到大鼠前脑缺血后L-型钙通道相互作用蛋白的变化，提示这些差异蛋白与L-型钙通道的结合很可能参与了缺血／缺氧性脑损伤，为下一步鉴定及研究L-型钙通道参与缺血性神经细胞死亡的机制奠定基础。