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结直肠癌是第三大常见癌症。大多数结直肠癌起源于腺瘤等前体病变,并向腺癌转化,整个过程涉及细胞生长、周期调控、信号传导、细胞与细胞外基质相互作用、血管与淋巴管生成等多个生物学行为,但根本原因在于细胞的基因组不稳定性。结肠直肠癌中已知的导致基因组不稳定的3种途径为:染色体不稳定（Chromos-omal instability,CIN）,微卫星不稳定（Microsatellite instability,MSI）和Cp G岛甲基化异常。其中CIN在结直肠癌发生中起重要作用,约占80%,其分子基础为癌基因、抑制癌基因、细胞周期调控基因等相互作用的结果。因此,为了提高结直肠癌的诊断与治疗水平,改善患者的预后,本研究旨在通过生物信息学及分子生物学技术对结直肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织的基因表达数据进行整合分析,获得与结直肠癌相关的潜在基因（IMPDH1）,并对IMPDH1对结直肠癌生物学行为的影响进行了探索,为结直肠癌的诊断、治疗等提供研究基础。第一部分基于生物信息学筛选与结直肠癌发生发展相关的潜在基因目的:通过生物信息学筛选结直肠癌组织与正常组织之间差异表达和差异甲基化基因,并探索其在结直肠癌发生发展中的分子作用机制。方法:1.从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中下载基因转录组和全基因组DNA甲基化表达数据集,进行数据分析,找出结直肠癌组织与正常组织之间的差异表达基因及差异甲基化基因。2.对差异表达基因和差异甲基化基因进行GO、KEGG功能及蛋白质相互作用（Protein-protein interaction,PPI）分析,分析差异基因及差异甲基化基因的作用机制。3.对差异基因及差异甲基化基因进行关联分析,明确甲基化对基因差异表达的影响。结果:1.通过对基因组数据分析,发现结直肠癌组织与正常组织之间的差异表达基因1958个,其中上调基因1025个,下调基因993个,其中差异表达基因IMPDH1位于表达上调基因的前50位;通过对结直肠癌组织与正常组织之间DNA甲基化数据集分析,得到2661个差异甲基化位点,包括2539个高DNA甲基化位点,122个低DNA甲基化位点,进一步分析得出差异DNA甲基化位点对应858个差异甲基化基因,包括800个高甲基化基因,58个低甲基化基因。2.通过GO功能分析发现差异表达基因和差异甲基化基因分别主要在细胞功能的DNA复制（DNA replication）和蛋白质结合（Protein binding）、生物过程的序列特异性DNA结合（Sequence-specific DNA binding）和亲和细胞通过质膜粘附分子粘附（Homophilic cell adhesion via plasma membrane adhesion molecules）及细胞组分的核浆组分（Nucleo-plasm）和质膜组分（Plasma membrane）中显著富集（P＜0.01）;通过KEGG功能分析发现差异表达基因和差异甲基化基因分别主要在细胞周期（Cell cycle）、DNA复制（DNA replication）、嘌呤代谢（Purine metabolism）,如IMPDH1和神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、c AMP信号通路（c AMP signaling pathway）、细胞粘附分子（Cell adhesion molecules）、PI3K-Akt、Rap1等通路中富集显著（P＜0.01）。其中,差异表达基因IMPDH1主要在GO功能分析中的嘌呤核糖核苷酸单磷酸生物合成、核浆和细胞质的组成及细胞功能的活性催化与KEGG功能分析的嘌呤代谢信号通路中显著富集（P＜0.05）。3.通过PPI网络分析,发现上述基因中互作度（Degree）较高的基因有SHMT2（Degree=44,Up）、FOXQ1（Degree=19,Up）、TRIP13（Degree=17,Up）、MDFI（Degree=16,Up）,其中与IMPDH1（Degree=7,Up）相互作用的蛋白包括SKP2、PODXL、FTSJ2、CHEK1、ANKRD9、BSGNTL1、LRRC8E等。4.通过差异基因及差异甲基化基因关联分析,发现一些基因,如下调的FBLIM1,GFRA2和WNT2是高甲基化基因,上调的MYC,B3GNTL1是低甲基化基因,而基因IMPDH1为非甲基化基因。结论:在GEO数据库中获得了大量的结直肠癌与正常组织之间差异表达和差异甲基化基因,这些基因主要通过影响核浆组分、序列特异性DNA结合、细胞周期、神经活性配体-受体相互作用等功能影响结肿瘤的发生、发展;进一步分析发现,差异表达基因IMPDH1为非甲基化基因,且主要通过嘌呤核糖核苷酸单磷酸生物合成、核浆和细胞质的组成、细胞功能的活性催化及嘌呤代谢信号通路等参与肿瘤的发生、发展;PPI蛋白网络分析发现,与IMPDH1相互作用的蛋白包括SKP2、PODXL、FTSJ2、CHEK1、ANKRD9、B3GNTL1、LRRC8E等;差异基因及差异甲基化基因关联分析提示,DNA甲基化可能影响基因的表达变化。第二部分IMPDH1等相关关键基因的验证及临床意义分析目的:通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据集及实时荧光定量PCR法验证结直肠癌发生发展相关关键基因的表达情况及临床意义分析。方法:1.利用TCGA数据集验证结直肠癌组织与正常组织之间差异表达基因在结直肠癌中的表达情况（包括478名结直肠癌患者和41名正常对照者）。2.通过荧光定量PCR法检测在表达谱中上调的基因及下调的基因在结直肠癌组织中的表达水平。3.通过R语言绘制ROC曲线和Kaplan-Meier（K-M）生存曲线,以评估这些基因对结直肠癌的诊断和预后价值。结果:1.在TCGA数据集中与结直肠癌发生发展相关的基因FOXQ1、CDH3、CLDN1、SHMT2、TRIP13、MDFI和IMPDH1表达上调（P＜0.01）,而GFRA2、SCGN、BEST4、CXCL12和CA7则表达下调（P＜0.01）,与基因测序结果一。2.通过荧光定量PCR法检测结果显示,结直肠癌组织中FOXQ1、CDH3、CLDN1、IMPDH1表达显著上调（P＜0.05）,GFRA2、SCGN、BEST4、CXCL12表达显著下调（P＜0.05）,与基因测序结果一致。3.通过R语言绘制ROC曲线与K-M生存曲线,结果显示GFRA2、FOXQ1、CDH3、CLDN1、SCGN、BEST4、CXCL12、CA7、SHMT2、TRIP13、MDFI和IMPDH1的AUC均大于0.7,提示上述基因对结直肠癌有一定诊断价值;而BEST4、SHMT2和TRIP13与患者生存率显著负相关（P＜0.05）。结论:通过TCGA数据库及q RT-PCR法对结直肠癌中关键基因进行验证,发现FOXQ1、CDH3、CLDN1、IMPDH1在结直肠癌组织中表达显著上调,GFRA2、SCGN、BEST4、CXCL12表达显著下调,与生物信息分析结果一致。通过ROC曲线及K-M生存曲线发现GFRA2、FOXQ1、CDH3,CLDN1、SCGN、BEST4、CXCL12、CA7、SHMT2、TRIP13、MDFI和IMPDH1可能是潜在的结直肠癌诊断生物标志物,BEST4、SHMT2和TRIP13可作为结直肠癌患者预后标志物。第三部分IMPDH1对人结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响目的:探讨IMPDH1基因对人结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法:1.实时荧光定量PCR法验证人正常结肠粘膜细胞FHC及人结肠癌细胞HT29、SW620、SW480中IMPDH1基因的表达情况。2.利用si RNA敲低人结肠癌细胞系中IMPDH1的表达,通过荧光定量PCR及Western blot法验证人结肠癌细胞中IMPDH1与关联基因YB-1的转录及蛋白表达水平。3.通过MTT、Transwell及划痕愈合实验,分析敲低IMPDH1基因表达对人结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。结果:1.通过实时荧光定量PCR法分析,结果显示IMPDH1在人正常结肠粘膜细胞及人结肠癌细胞中均有表达,人结肠癌细胞中表达水平高于人正常结肠粘膜细胞。2.si RNA转染人结肠癌细胞SW480及HT29后,IMPDH1及关联基因YB-1在转录及蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。3.MTT实验结果显示,敲低IMPDH1基因表达能抑制人结肠癌细胞SW480、HT29的体外增殖能力（P＜0.05）。4.Transwell实验结果显示,敲低IMPDH1基因表达能抑制人结肠癌细胞SW480、HT29体外侵袭能力（P＜0.05）。5.划痕愈合实验表明,敲低IMPDH1基因表达能抑制人结肠癌细胞SW480、HT29的体外迁移能力（P＜0.05）。结论:IMPDH1在人结肠癌细胞中的表达水平高于人正常结肠粘膜细胞。抑制IMPDH1表达可能抑制YB-1基因m RNA及蛋白的表达。敲低IMPDH1表达后,在体外可以抑制结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。