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胃癌是由于胃部黏膜上皮癌变而发生的消化道恶性肿瘤,其发病率及病死率在所有恶性肿瘤中均排名在前几位。相对于世界其它地域而言,东亚地区由于其独特的地理环境因素,其胃癌的发病率和病死率在全球范围内均处于显著高水平。而人口基数庞大的我国由于医疗条件尚不平衡以及部分居民医疗观念相对落后,我国胃癌患者的发病率及死亡率均居世界之首,是名副其实的胃癌大国。我国胃癌患者又以进展期居多,晚期患者亦有相当比例,此类患者大多需要进行术前新辅助化疗、术前转化治疗、术后辅助治疗以及单纯化疗,而化疗耐药又是影响胃癌患者预后的一个至关重要的独立因素,严重威胁着我国人民的生命健康。化疗耐药产生的机制主要包括肿瘤细胞对药物的摄取减少和/或外排增加、细胞内靶物质水平和/或结构的改变、药物在胞内激活减少和/或失活增多以及DNA损伤修复等。我们在努力提高手术技术水平的同时还应该积极探寻可能导致胃癌发生发展的癌基因和/或抑癌基因,从而发现新的标记物对胃癌的诊断、治疗方案的选择、化疗耐药的评估以及预后的判断提供依据。Krüppel样转录因子（krüppel like factors,KLFs）最早被人们发现于果蝇的胚胎发育调控因子之中,后续的研究表明此锌指蛋白样转录因子家族广泛表达于哺乳动物真核细胞中,并在心血管系统疾病、肥胖、炎症以及肿瘤等疾病的发生及发展过程中扮演了重要角色。经过数十年的研究,目前人们发现的KLF家族成员数量已经达到了 17个。而KLF17作为近几年发现的KLF家族新成员已被发现其表达异常与食管鳞癌、乳腺癌、肝癌以及结直肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关,参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为的调控。但对于KLF17表达水平异常与胃癌胃发生发展关系的研究还罕有报道,需要我们深入探索研究其具体机制。在此研究中,我们分别采用了 RNA及蛋白提取技术、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、蛋白印迹法（Western Blot）、免疫组织化学染色、质粒大提、细胞转染、细胞增殖实验（MTS法）、流式细胞学以及双荧光素酶报告基因检测等实验方法。首先,我们验证了胃癌患者胃癌组织与癌旁组织中KLF17在mRNA水平及蛋白水平上的表达差异具有统计学意义。然后我们又检测了胃癌组织中耐药及凋亡相关基因的表达水平,并分析了它们与相应胃癌组织中KLF17表达水平的相关性。在此之后我们又在细胞水平测定了人正常胃黏膜上皮细胞株与不同分化程度的人胃癌细胞株中KLF17在mRNA水平及蛋白水平的的表达差异及趋势。此后我们构建了载有KLF17的质粒,转染胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901后通过流式细胞术和MTS实验检测了过表达KLF17后胃癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fu）化疗敏感性及细胞凋亡的影响。接下来我们又对上述细胞株中KLF17过表达前后胃癌细胞耐药及凋亡相关蛋白的变化进行了测定。最后,我们以BGC-823胃癌细胞株作为实验对象,应用双荧光素酶报告基因检测技术研究了 KLF17的下游作用靶点,进一步明确其调控胃癌细胞化疗耐药性的潜在生物学机制,从而为更加深入的探索及研究胃癌发生发展及化疗耐药的生物学机制开拓了一条新思路。第一部分KLF17在胃癌中的表达及与耐药、凋亡相关基因表达的相关性目的:验证KLF17在胃癌患者肿瘤组织与癌旁组织、GES-1细胞株与不同分化程度胃癌细胞株中mRNA和蛋白质水平的表达差异,并分析胃癌组织中KLF17表达水平与耐药及凋亡相关基因表达水平的相关性。方法:1.分别应用RT-qPCR技术、Western Blot技术及免疫组织化学技术检测KLF17在60对胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中mRNA和蛋白质水平上的表达。2.分别应用RT-qPCR技术和Western Blot技术检测KLF17在GES-1细胞株及4种不同分化程度的胃癌细胞株中mRNA和蛋白水平上的表达。3.应用RT-qPCR技术检测胃癌组织中耐药相关基因MDR1、GST-π以及凋亡相关基因Cyclin D1、Bcl-2、Bax的表达水平,并分析它们与相应胃癌组织中KLF17表达水平的相关性。结果:1.无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上,KLF17在胃癌组织中的表达水平均显著低于癌旁正常组织,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.KLF17 在 HGC-27、BGC-823、SGC-7901、NCI-N87 四种胃癌细胞株中mRNA及蛋白水平上的表达均显著低于其在GES-1细胞株,差异有统计学意义（P＜0.05）且差异大小与胃癌细胞株的分化程度呈负相关趋势。3.胃癌组织中KLF17在mRNA水平上的表达与MDR1、Cyclin D1及Bcl-2呈负相关（P＜0.05）,而与GST-π及Bax无显著相关性（P＞0.05）。小结:1.KLF17是胃癌一个抑癌基因,其表达降低在胃癌发生及进展过程中扮演了重要角色。2.与正常胃黏膜上皮细胞株相比,胃癌细胞株中KLF17的mRNA及蛋白表达水平均显著降低,证明其可以作为后续细胞功能实验的研究对象。3.胃癌组织中KLF17的表达水平与耐药相关基因MDR1及凋亡相关基因Cyclin D1、Bcl-2的表达水平呈负相关,提示了其作为一个诊疗胃癌化疗耐药新靶点的潜在可能。第二部分KLF17对胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901化疗耐药性的影响目的:研究KLF17过表达对胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823化疗耐药性的影响。方法:1.构建pcDNA3.1-KLF17以及pcDNA3.1空载质粒,用它们分别转染SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株。2.应用RT-qPCR及Western Blot技术检测转染后SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中KLF17在mRNA和蛋白水平表达上的变化,以此来验证转染pcDNA3.1-KLF17质粒后胃癌细胞株中KLF17过表达的效果。3.运用MTS和流式细胞学技术检测转染pcDNA3.1-KLF17质粒后SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株化疗敏感性以及细胞凋亡水平的变化。结果:1.RT-qPCR 和 Western Blot 结果显示:pcDNA3.1-KLF17 质粒转染组SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中KLF17表达水平相较于原胃癌细胞株（Ctr组）显著增高（P＜0.05）,而空载质粒转染组（Vector组）则无明显变化。2.MTS结果显示:pcDNA3.1-KLF17质粒转染组胃癌细胞株在5-Fu不同浓度梯度环境下的细胞生长抑制率曲线曲度均较Vector组增大,IC50值也较Vector组明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.流式细胞学结果显示:pcDNA3.1-KLF17质粒转染组细胞株在经过相同浓度的5-Fu处理24h后细胞的细胞凋亡率均较Vector组明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.通过质粒转染成功构建出KLF17过表达的SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株。2.KLF17过表达能够显著上调SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株对5-Fu的化疗敏感性及细胞凋亡水平,提示了 KLF17表达的降低参与了胃癌化疗耐药的发生发展过程。第三部分KLF17影响胃癌细胞化疗耐药性的分子机制目的:研究探索KLF17调控胃癌细胞化疗耐药性的相关生物学机制。方法:1.应用RT-qPCR及Western Blot技术检测KLF17过表达前后胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823中Cyclin D1、耐药以及凋亡相关蛋白的表达变化。2.应用双荧光素酶报告系统检测KLF17与Cyclin D1的生物学关系。结果:1.RT-qPCR及Western Blot结果显示:相较于Ctr组和Vector组,KLF17过表达组胃癌细胞株Cyclin D1、P-gp和Bcl-2的表达水平呈显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;GST-π和Bax的表达水平则无明显变化。2.双荧光素酶报告基因技术结果表明:KLF17过表达能够显著抑制Cyclin D1基因启动子的转录活性,差异有统计学意义（P＜0.05）;而将KLF17与Cyclin D1基因启动子结合位点的序列突变后则无明显抑制效果。并且KLF17对Cyclin D1基因启动子转录活性的抑制作用存在显著的KLF17剂量依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中,KLF17过表达能够显著下调Cyclin D1、耐药相关蛋白P-gp以及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,提示了 KLF17可能通过调控Cyclin D1、P-gp和Bcl-2的转录表达来影响胃癌细胞的化疗耐药性。2.在BGC-823胃癌细胞中,KLF17作为Cyclin D1的上游调控因子,能够通过直接结合Cyclin D1启动子并抑制其转录活性来调控胃癌细胞化疗耐药的发生发展过程。结论:1.KLF17在人胃癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达,且与耐药相关基因MDR1及凋亡相关基因Cyclin D1、Bcl-2的表达呈负相关;KLF17在人永生化胃粘膜上皮细胞株中的表达均高于其在人胃癌细胞株中的表达,且胃癌细胞分化程度越低差异越明显,说明了 KLF17表达下降可能参与了胃癌的发生发展过程并在胃癌化疗耐药过程中扮演了重要角色。2.KLF17过表达能够显著上调SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株对5-Fu的化疗敏感性及细胞凋亡水平,提示了 KLF17在胃癌化疗耐药性的发生发展过程中发挥了其相关生物学功能。3.在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中,KLF17过表达能够显著下调Cyclin D1、耐药相关蛋白P-gp以及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,提示了 KLF17可能通过调控Cyclin D1、P-gp和Bcl-2的转录表达来影响胃癌细胞的化疗耐药性。4.在BGC-823胃癌细胞中,KLF17作为Cyclin D1的上游调控因子,能够通过直接结合Cyclin D1启动子并抑制其转录活性来调控胃癌细胞化疗耐药的发生发展过程。