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[目的]观察糖基化终产物(AGEs)及高糖对体外培养兔视网膜MUller细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,从而进一步探讨糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的机制。
[方法]取健康新西兰大白兔,处死后以最快速度在无菌条件下摘取眼球,采用组织块贴壁法培养兔视网膜Mtlller细胞;用含有胎牛血清的高糖型DMEM作为培养液,不添加生长因子。用牛血清白蛋白(BSA)及无水葡萄糖体外制备AGEs-BSA及其对照物,用低糖型DMEM、高糖型DMEM及无水葡萄糖制备含有不同浓度葡萄糖的DMEM培养液。取P<,2>代兔视网膜.Muller细胞接种于预置有小玻片的六孔培养板用于实验,分为AGEs-BSA实验组、AGEs-BSA对照组、空白对照组及高糖实验组。根据AGEs-BSA及其对照物浓度(以两者占DMEM培养液的体积分数表示)将前两组又各分为5个浓度组,分别为80、160、320、640、1280μL·(2000μL)<-1>:根据DMEM培养液中葡萄糖浓度将高糖实验组又分为6个浓度组,分别为5.5、10、20、30、40、50 mmol·L<-1>。每组分别干预3d、6d、9d后,采用免疫细胞化学方法检测各组兔视网膜MUller细胞VEGF的表达情况。免疫细胞化学图像用IPP 5.0.1分析软件进行半定量分析,对比各组细胞’VEGF表达的平均光密度值,并作统计学处理。
[结果]培养的兔视网膜MUller细胞呈单层密集生长,胞体呈长梭形,胞浆丰富,胞核位于胞体中央、呈椭圆形、有2个或2个以上核仁,具有活体细胞的形态特征。免疫细胞化学半定量检测法显示,兔视网膜Mtiller细胞经过含不同浓度.AGEs-BSA及其对照物的DMEM培养液干预培养后,与空白对照组相比,AGEs-BSA实验组除了最低浓度组(即AGEs.BSA体积分数为80μL·(2000μL)<-1>)外,其余各浓度组在3d、6d、9d 3个时间点VEGF表达均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与AGEs.BSA对照组相比,AGEs-BSA实验组除了最低浓度组在3d、6d以及最高浓度组(即.AGEs-BSA体积分数为1280μL·(2000gL)<-1>)在3d外,其余各组VEGF表达均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。同时AGEs-BSA增强视网膜Mtiller细胞’VEGF表达的影响在一定的浓度及时间范围内具有浓度及时间依赖性,但当AGEs-BSA达最高浓度后,VEGF表达则较前有所减少,但与空白对照组及AGEs-BSA对照组相比仍有增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。②高糖实验组结果显示,兔视网膜Mtiller细胞VEGF的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(P<0.05),但至最高浓度组(即DMEM培养液中葡萄糖浓度为50 mmol·L<-1>)VEGF的表达又有所下降(P<0.05)。而随着干预时间的延长,Mtiller细胞VEGF的表达未见明显规律的变化。
[结论]AGEs可显著增强MUller细胞VEGF的表达,且在一定范围内随着AGEs浓度的增加及作用时间的延长呈递增趋势;一定范围内,随着葡萄糖干预浓度的增加,MUller细胞VEGF的表达显著增加。提示高糖作为DR的始动因素之一,其可能机制之一为高糖诱导视网膜MUller细胞VEGF的表达,同时高糖条件下累积生成的AGEs也能够明显增加MUller细胞VEGF的表达。