荔枝高密度遗传图谱构建及重要性状的QTL定位

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遗传图谱是一种有效的辅助育种工具。较高质量的遗传图谱能够有效地进行QTL定位等研究。本研究对荔枝基因组测序及重测序数据开发用于杂交后代真杂种鉴定的纯合共显性分子标记。开展真杂种鉴定,获取一批用于图谱构建的真杂种群体,同时比较了同一杂交组合不同授粉方式和不同杂交组合杂交效率的差异。对’紫娘喜’为母本,’无核荔’为父本的授粉后代进行真杂种鉴定,构建了包含250个F1子代的作图群体。通过简化基因组测序完成了作图群体子代基因型的鉴定,然后使用Joinmap4.0构建荔枝高密度遗传连锁图。同时,连续2年对作图群体的13个性状(节间长、复叶主轴长、叶绿素含量、光合速率、炭疽病斑直径等)进行调查,对符合正态分布的表型性状进行了 QTL扫描。根据荔枝参考基因组的注释结果,对QTL区间包含的基因进行分析,筛选了一些控制相关性状的候选功能基因。主要结果如下:1.开发建立了一套荔枝InDel分子标记开发流程,依据荔枝参考基因组和37份重测序数据共设计218对InDel引物。提取20个荔枝杂交组合的亲本(白糖罂,B;大丁香,D;妃子笑,F;三月红,S;新球蜜荔,X;玉谭蜜荔,Y;无核荔,W;紫娘喜,Z)的DNA,通过8%PAGE胶电泳检测引物的多态性。通过筛选发现有111对引物在上述亲本间具有多态性。多态性标记的聚类分析表明,3个早熟品种(B,F和S)聚类在一起,而其余5个晚熟品种聚类在一起。获得了一批能够区分8个亲本的纯合共显性分子标记。2.对20个杂交组合(’紫娘喜’ X ’无核荔’和’紫娘喜’ X ’妃子笑’等)的部分后代进行真杂种鉴定,共检测2800个单株,其中1880个单株鉴定为真杂种,真杂种率为67.14%。不同的杂交组合间真杂种率不尽相同,其中’玉谭蜜荔’ X ’三月红’最高,’新球蜜荔’ X ’桂早荔’最低,说明不同亲本的亲和性有差异。对’白糖罂’X ’妃子笑’杂交组合开展了不同授粉方式效率的研究。结果表明,网室授粉是一种高效的杂交育种方式,能够在较短的时间内获得较多的真杂种后代。3.随机选择250株’紫娘喜’ X ’无核荔’杂交后代中鉴定为真杂种的单株,连同亲本一起提取高质量的DNA。对DNA用HaeⅢ和Hpy166Ⅱ两种限制性内切酶进行酶切,回收314-514 bp的片段进行高通量建库测序。总共获得302.56 Gb的原始数据和1415.69 M的reads。以荔枝基因组数据为参照,使用GATK和samtools两种软件对测序亲本及子代的reads进行SNP标记开发和变异检测,共检测到11,255,471个SNP标记。4.根据在后代中的分离比例对标记进行分型,能成功分型的有3,789,874个,可以用于遗传图谱构建的标记有3,353,448个,过滤后得到10710个标记用于遗传图谱构建。其中有8个单株的标记分型异常,初步判定这8个单株为假杂种。根据作图标记分型结果,使用JoinMap 4.0软件对荔枝遗传图谱进行构建,设置MLOD>5,将10710个标记分配到15个连锁群中,获得的图谱总图距为1566.45 cM,平均图距为0.15 cM,是目前已知的密度最高的遗传图谱。其中最大共的连锁群是LG02,最小的连锁群是LG05。最密的连锁群是LG01,平均图距为0.13 cM,标记最多的连锁群是LG02,最大的gap为8.07 cM。5.分别于2017年和2018年对荔枝的叶绿素含量、炭疽病斑直径、叶形指数、比叶重等13个性状进行测定,并对性状数据进行正态性检验及去除异常值(离均差绝对值大于3倍标准差)。2017年的性状测定结果显示,共有6个性状服从正态分布,分别为:叶柄长、节间长、复叶主轴长、叶绿素含量、叶形指数、炭疽病斑直径。使用MapQTL 5.0对6个性状进行QTL定位,共检测到29个QTL区间,共计5447个基因。2018年的性状测定结果显示,共有10个性状服从正态分布,分别为:叶柄长,复叶主轴长,叶绿素含量,叶形指数。通过QTL定位,共检测到19个QTL区间,共计4006个基因。6.对两年的定位结果进行比较分析发现,复叶主轴长和叶形指数分别具有2个和6个重合的QTL区间,经过检索发现这8个区间中共包含1181个基因。通过比较基因注释结果发现该区域包含一些与该性状相关的基因,如生长素响应、细胞伸长和细胞数量调控等相关基因。综上所述,本研究开发了一批荔枝InDel标记,对’紫娘喜’ X ’无核荔’、’紫娘喜’ X ’妃子笑’、’紫娘喜’ X ’三月红’等20个荔枝杂交F1代进行了真假杂种鉴定,真杂种率为67.14%;构建了总图距为1566.45 cM,,平均图距为0.15 cM的荔枝高密度遗传图谱,是目前已知的最高密度的荔遗传图谱;2017年和2018年分别对荔枝的6个和10个性状进行QTL定位,分别定位到29和19个QTL区间,根据荔枝基因组注释结果筛选出部分与该性状相关的基因。
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