“渥堆”是普洱茶发酵的关键工序，其实质是微生物及其分泌的胞外酶参与的固态发酵过程。微生物在普洱熟茶的制作中起着重要的作用，目前国内外的研究主要通过分离筛选的方法围绕着霉菌和酵母的类群、生长特性与数量等方面进行开展，对真菌和细菌群落结构、变化规律和相互关系的研究鲜有报道。另外，微生物类群的变化与主要酶系活性的强弱存在高度的关联性，但是，大部分研究对于普洱茶发酵过程中主要酶类的来源只有笼统的介绍，缺乏对其深入的研究。本文通过PCR-DGGE技术来研究少量茶叶发酵制备普洱茶的过程中细菌和真菌群落结构的多样性和动态变化，针对分离得到的微生物，通过分子生物学技术对主要酶类——多酚氧化酶和单宁酶基因进行克隆，为微生物在普洱茶发酵中作用机理的研究提供一定的数据和参考依据。主要结论如下：1.通过DGGE图谱对3种DNA提取方法反映的微生物多样性完整性的比较，确定了液氮冻融法为普洱茶微生物总DNA的提取方法。2. PCR-DGGE技术分析结果可知：普洱茶发酵过程的优势细菌分为3大类群：γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）、β-变形菌纲（β-proteobacteria）和杆菌纲（Bacilli），共10个属。真菌分为2大类群：散囊菌目（Eurotiales）和酵母目（Saccharomycetales），共4个属。3.普洱茶堆表和堆芯的微生物群落结构差异小，细菌和真菌的群落结构均在二翻时产生显著变化，芽孢杆菌属在整个发酵过程中逐渐增加，成为发酵后期的主要优势细菌；嗜热淀粉芽孢杆菌自始至终存在；部分细菌在发酵过程中消失；黑曲霉主要存在于发酵前期，在二翻时数量顶峰；烟曲霉自始至终存在普洱茶的堆表堆芯中，数量变化不明显，Arxula adeninivorans在二翻时出现并成为发酵后期最优势的真菌。4.细菌和真菌之间相互依存、相互竞争。黑曲霉的迅速增长促进了两种酵母迅速繁殖，同时使细菌的生长繁殖受到抑制，导致部分菌群减少甚至消失。5.通过培养基筛选、16S rRNA PCR和18S rRNA测序鉴定，从普洱茶发酵样品中分离到一株细菌B1，为芽孢杆菌属的一个未知种，与嗜热芽孢杆菌Bacillus shackletonii的相似性达到98%；两株曲霉属真菌A1和A3，分别为黑曲霉和烟曲霉；一株酵母菌Y2，为Arxula adeninivorans。6.设计多酚氧化酶（包括漆酶、酪氨酸酶）和单宁酶基因引物对，成功扩增到黑曲霉的漆酶基因、烟曲霉的漆酶基因和单宁酶基因序列，初步评估分离得到的黑曲霉和烟曲霉可能分泌漆酶，与茶汤颜色由黄绿转变为黄红明亮的变化有关，烟曲霉可能分泌单宁酶，与简单儿茶素、没食子酸的形成相关。