花生黄曲霉毒素的生物防控方法及菌剂的研究

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黄曲霉毒素是一种由曲霉属分泌的强致癌、致突变物质,对生物安全和人类健康有巨大危害。花生具有“地上开花、地下结果”的特点,花生荚果与土壤直接接触,极易受到黄曲霉毒素的污染,因此,对花生黄曲霉毒素污染的防控十分重要,急需找到安全有效的防控方法。生物防控因其成本较低、效果良好、对环境无二次污染而受到越来越多的关注。利用不产毒黄曲霉菌通过竞争抑制作用降低谷物中黄曲霉毒素含量被证明是一种有效的办法。本研究将利用形态学鉴定结合PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性分析)技术从我国花生主产区河南当地土壤中筛选出不产毒黄曲霉菌作为生防菌,应用固定化微生物技术制备温度响应型固定化微球菌剂,并在其基础上制备炭基双层微球菌剂,对炭基微球菌剂的吸湿特性及在土壤中释放机制进行了分析,通过田间实验和盆栽实验评估了生防菌剂在花生黄曲霉毒素污染上的防控效果。本文主要研究内容如下:(1)筛选了不产毒黄曲霉菌作为生防菌并对其特性进行了评估利用形态学鉴定结合PCR-RFLP方法从从我国花生主产区河南当地土壤中筛选出一株具有很强拮抗能力和定殖能力的不产毒黄曲霉菌,在大豆培养基和花生仁上对产毒菌产生的AFB1的抑制率分别可达到67.52%和59.76%。花生种植中使用的农药甲霜灵在正常应用浓度范围对不产毒黄曲霉菌没有抑制作用。筛选出的不产毒黄曲霉菌可以作为生防菌来源。(2)制备了温度响应型智能菌剂通过固定化微生物技术制备了固定化微球菌剂,确定了以淀粉、海藻酸钠为基质,不产毒黄曲霉菌悬液为生防菌来源的制备微球菌剂最佳工艺。在此基础上引入温敏凝胶,制备的温度响应型固定化微球菌剂的敏感温度在29~30°C范围内,符合生防菌剂施加关键时期花生初花期的温度要求。该温度响应型微球菌剂中生防菌的释放是持续、可控的,且具有良好的温度敏感性。温度响应型智能菌剂可以满足早期施加后在土壤中具有缓释效果,让环境中不利条件对生防菌的影响减弱,而温度达到花生初花期温度(30.5~33.2℃)时可以突然释放,大量扩增到环境中,从而更好满足实际应用效果。(3)制备了炭基双层固定化微球菌剂在温度响应型固定化微球菌剂的基础上,以不产毒黄曲霉菌为生防菌来源,利用两步法制备了炭基双层固定化微球。固定化微球中生物炭的加入可以显著提高微球中生防菌的包埋率,同时可以改善土壤的保水性能。壳聚糖包衣的炭基双层微球在一定时间内对土壤中常见的枯草芽孢杆菌和黑曲霉具有一定的抑制作用,可以减小菌剂施用后对生防菌的干扰。炭基双层固定化微球具有良好的温度响应性和控释效果,其释放特性与温度响应型菌剂相似。(4)对炭基菌剂的吸湿特性及其在土壤中的释放机制进行了分析利用静态称重法对生物炭、炭基菌剂和土壤的吸湿特性进行了评估。炭基菌剂施加到土壤后可以有效提高土壤的平衡含水量,改善土壤持水性。在15℃~35℃范围内,修正Henderson模型能更好地评估生物炭、土壤的平衡含水量与温度、湿度的关系。相对湿度与含水量、温度的关系模型可以评估炭基菌剂的水分活度,为生防菌剂的微生物生长、孢子萌发条件提供理论参考。三层扩散的释放机制符合炭基菌剂中的生防菌在土壤中的释放过程,可以较好地预测菌剂在土壤中的释放特征。对生防菌剂的开发,控释特性的研究具有一定的理论意义。(5)研究了不产毒黄曲霉生防菌剂防控花生黄曲霉毒素的应用效果通过田间实验和盆栽实验对不产毒黄曲霉菌生物防控花生黄曲霉毒素污染的应用效果进行了评估。连续两年的田间实验表明筛选出的不产毒黄曲霉菌通过竞争抑制作用降低花生中黄曲霉毒素污染的生物防控方法在我国河南花生主产区是行之有效的。生防菌剂在土壤中施加可以改变土壤中产毒菌与不产毒菌的比例。花生初花期为菌剂施加最佳时期,初花期施加大米菌剂可以将土壤中不产毒菌比例提高至92.41%。对菌剂用量进行评估时,高温、干旱的天气条件胁迫下,初花期1 kg/亩的大米菌剂施加可以将花生中AFB1含量降低75.66%。炭基双层微球菌剂外层抑菌层在播种期至花期前的一定时间内对土壤中微生物有抑制作用,减少了对菌剂中生防菌的干扰。播种期在土壤中施加炭基双层固定化微球菌剂使得生防菌的定殖效果和花生黄曲霉毒素防控效果与花期施加大米菌剂效果相当,表明该炭基双层菌剂适合在播种期土壤中施加,为农业上的应用提供方便。本文的研究可以为我国花生黄曲霉毒素污染的生物防控提供技术和数据参考,为花生黄曲霉毒素污染防控的生物农药的开发应用提供理论和技术支撑,对农业的可持续发展具有重要意义。
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