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目的采用不同浓度的邻苯二甲酸单（2-乙基）己基酯[mono（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]处理小鼠睾丸间质细胞（TM-3）,检测细胞形态、线粒体超微结构、线粒体损伤状况以及其线粒体自噬相关基因和蛋白的表达水平。基于PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/帕金森蛋白（Parkin）信号通路探讨MEHP对TM-3细胞线粒体自噬的影响,为进一步揭示MEHP的生殖毒性提供相应的理论依据。方法不同浓度的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）（0,0.25,0.5,1.0,1.25,1.5mmol/L）干预TM-3细胞24 h后,使用CCK-8法对TM-3细胞活力进行测定,确定最终干预剂量;设立对照组（完全培养基）、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组和抑制剂组（400μmol/L MEHP+1.0 mmol/L 3-MA）;光镜下观察TM-3细胞形态结构;透射电镜下观察TM-3细胞超微结构;ATP检测试剂盒检测TM-3细胞腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平的变化;JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测TM-3细胞线粒体膜电位（MMP）水平的变化;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）检测TM-3细胞PINK1、Parkin m RNA的表达水平;蛋白免疫印迹（Western blot）检测线粒体自噬相关蛋白PHB2（抗增殖蛋白2）、PINK1、Parkin、磷酸化Parkin（P-Parkin）表达水平的变化。结果1.光镜结果:对照组TM-3细胞呈长梭形,细胞间隙清楚,呈突触状向四周扩散;200μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞数量略少于对照组,个别细胞形态改变,细胞皱缩;400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组明显可见TM-3细胞形态发生改变、边缘模糊、细胞间隙增大、细胞数量明显减少,800μmol/L MEHP染毒组甚至可见成团飘浮的死亡细胞。电镜结果:视野下可见对照组细胞膜结构清楚、边缘清晰,线粒体、内质网等细胞器结构相对完整;与对照组比较,200、400、800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞核核膜固缩,核周部分线粒体形态改变,出现线粒体皱缩的现象,线粒体发生损伤,并伴有线粒体自噬小体的生成。ATP测定结果:与对照组比较,MEHP各个染毒组均可引起TM-3细胞内ATP水平的降低（P均＜0.05）;与200μmol/L MEHP染毒组比较,800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞ATP水平下降（P＜0.05）;与400μmol/L MEHP染毒组比较,800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞ATP水平降低（P＜0.05）。线粒体膜电位测定结果:200μmol/L MEHP染毒组线粒体膜电位与对照组相比差异较小（P＞0.05）,400、800μmol/L MEHP染毒组与对照组相比绿色荧光细胞数逐渐增多,线粒体膜电位下降（P均＜0.05）,随着MEHP染毒浓度的增加,线粒体膜电位呈现出减少的趋势;与200μmol/L MEHP染毒组相比,400、800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞线粒体膜电位水平显著下降（P均＜0.05）;与400μmol/L MEHP染毒组相比,800μmol/L MEHP染毒组细胞线粒体膜电位水平降低（P＜0.05）。RT-q PCR检测结果:MEHP各染毒组PINK1 m RNA的相对表达水平均超过正常对照组水平（P均＜0.05）;400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞中PINK1 m RNA相对表达水平高于200μmol/L MEHP染毒组（P＜0.05）;与400μmol/L MEHP染毒组相比,800μmol/L MEHP染毒组TM-3细胞中PINK1 m RNA相对表达水平上升（P＜0.05）;与对照组相比,MEHP各染毒组的Parkin m RNA相对表达水平均降低（P均＜0.05）;与200μmol/L MEHP染毒组相比,400μmol/L、800μmol/LMEHP染毒组细胞中Parkin m RNA相对表达水平均降低（P均＜0.05）,与400μmol/L MEHP染毒组相比,800μmol/L MEHP染毒组细胞中Parkin m RNA相对表达水平下降（P＜0.05）。Western blot结果表明:MEHP各个染毒组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相对表达水平均高于对照组（P均＜0.05）;400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组Parkin蛋白的相对表达水平均低于对照组（P均＜0.05）;与200μmol/L MEHP染毒组相比,400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升（P均＜0.05）,400μmol/L、800μmol/L MEHP染毒组Parkin蛋白相对表达水平下降（P＜0.05）;与400μmol/L MEHP染毒组相比,800μmol/L MEHP染毒组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升（P均＜0.05）,800μmol/L MEHP染毒细胞中Parkin蛋白相对表达水平下降（P＜0.05）。2.CCK-8结果表明:加入自噬抑制剂3-MA后,TM-3细胞存活率呈现出先增加后降低的趋势,当3-MA浓度为1.0 mmol/L时,细胞存活率与对照组相比差异无统计学意义,从而确定抑制剂组最终的干预剂量为1.0 mmol/L。抑制剂组TM-3细胞存活率低于对照组（P＜0.05）,抑制剂组细胞存活率低于400μmol/L MEHP染毒组（P＜0.05）。光镜结果:对照组细胞形态正常,且细胞排列较为紧凑;400μmol/L MEHP染毒组、抑制剂组细胞外部形态发生改变,出现肿胀变圆的细胞,细胞间隙明显变大,可见漂浮的死亡细胞。电镜结果:电镜视野下可见对照组细胞核膜光滑平整、结构清楚、边缘清晰,线粒体等细胞器结构完整;400μmol/L MEHP染毒组和抑制剂组TM-3细胞核膜固缩,核周部分线粒体形态改变,出现线粒体皱缩的现象。ATP检测结果显示:与对照组相比,抑制剂组ATP含量减少（P＜0.05）,与400μmol/LMEHP染毒组相比,抑制剂组ATP水平下降（P＜0.05）。线粒体膜电位检测结果显示:与对照组相比,抑制剂组TM-3细胞绿色荧光强度增加,线粒体膜电位下降（P＜0.05）,与400μmol/L MEHP染毒组相比,抑制剂组TM-3细胞绿色荧光细胞数增加,线粒体膜电位下降（P＜0.05）。RT-q PCR结果表明:抑制剂组PINK1 m RNA相对表达水平低于400μmol/L MEHP染毒组（P＜0.05）,Parkin m RNA相对表达水平高于400μmol/L MEHP染毒组（P＜0.05）。Western blot结果分析表明:抑制剂组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相对表达水平均低于400μmol/L MEHP组（P均＜0.05）,Parkin蛋白的相对表达水平高于400μmol/L MEHP组（P＜0.05）。结论MEHP可导致线粒体的形态结构及功能改变,并诱导PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬。