橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种危害数百种果蔬的重要农业害虫,每年在中国乃至亚洲造成重大经济损失。RNAi是一种在真核生物中由ds RNA诱发的m RNA特异性降解的机制,由于其高效简便等特点,广泛应用于基因组学,医学以及农业等方面的研究。虽然RNAi在真核生物中高度保守并且在农业害虫的研究中取得了长足发展,但将其应用于实践生产还存在许多问题待解决,例如在双翅目果蝇中喂食法不能诱导RNAi效应以及在橘小实蝇中存在对RNAi免疫耐受的现象。本研究探索了橘小实蝇对RNAi免疫耐受的分子调控机制,揭示了橘小实蝇中脂肪酸的生物合成与代谢通路在其对RNAi的免疫耐受反应中起重要作用。并且证明了脂肪酸延伸酶对橘小实蝇的体液免疫通路也具有重要的调控作用。1.已免疫橘小实蝇血淋巴能诱导未经处理的橘小实蝇对RNAi的免疫耐受反应。喂食橘小实蝇ds-rpl19,并确定成功诱导了RNAi免疫耐受反应后,提取血淋巴注射并注射进未处理的橘小实蝇中。在注射已免疫组血淋巴后喂食ds-rpl19的橘小实蝇中,目的基因未出现下调。而注射对照组血淋巴后再喂食ds RNA的橘小实蝇中则出现了显著的RNAi效应,靶标基因的表达量减少了51%。同时,将血淋巴在25°C下分别处理1 d、2 d、3 d或将血淋巴液经-20°C低温处理后注射,均不会影响其对RNAi免疫耐受的诱导能力。而经100°C高温处理10 min后,血淋巴液丧失诱导RNAi免疫耐受反应。注射经高温处理后的血淋巴液再喂食ds RNA,目的基因的表达量出现了48%的下调。这些结果表明已对RNAi免疫耐受的橘小实蝇血淋巴中存在可能的―诱导因子‖调控橘小实蝇的RNAi免疫耐受反应,并且该―诱导因子‖具有热不稳定性而在室温下能较长时间保持诱导能力。2.通过比较免疫组和对照组橘小实蝇血淋巴中各种化学组分的含量,发现免疫组橘小实蝇血淋巴中亚油酸:花生四烯酸的比例上升。通过免疫组和対照组橘小实蝇血淋巴代谢组学分析,我们一共鉴定出37种表达量有差异的代谢产物,其中17中代谢产物在免疫组血淋巴中含量显著升高,另外20种在対照组血淋巴中含量较高。在所有鉴定出的代谢产物中,含有14种磷脂和11种不同链长及饱和程度的脂肪酸,差异代谢产物中脂质所占比例达到了67.57%。进一步分析代谢组的数据发现,在免疫组橘小实蝇血淋巴中亚油酸:花生四烯酸的比值为11.5:1,显著高于对照组中的9.8:1,表明花生四烯酸的含量相对减少了。我们将免疫组血淋巴中含量较高的物质分别注射进未经处理的橘小实蝇中并喂食ds RNA,发现注射亚油酸后可以诱导橘小实蝇对RNAi的免疫耐受反应。注射浓度为100μM和200μM的亚油酸后喂食ds RNA完全不能引起目的基因的下调;注射浓度为50μM的亚油酸后再喂食ds RNA,导致目的基因转录水平下调30%,而注射DMSO的对照组中目的基因表达量降低了55%,与注射50μM亚油酸的处理组间存在显著差异。这些结果表明亚油酸在橘小实蝇中诱导的RNAi免疫耐受反应随注射浓度的降低而减弱。注射200μM亚油酸后,橘小实蝇对RNAi的阻碍效果可以持续48 h。同时我们检测了注射200μM亚油酸后橘小实蝇中胞吞相关基因的表达,发现bet3、pi3k、nina c、vha16-1、vha-sfd、arf72a和ap50等基因出现了25%-65%的下调。免疫荧光染色的结果也显示,注射亚油酸导致ds RNA分子不能正常通过胞吞作用进入橘小实蝇肠道细胞中。我们在已免疫橘小实蝇中注射浓度为50μM、100μM以及200μM花生四烯酸再喂食ds RNA,结果显示靶标基因分别下调了50%、67%和46%。同时在已免疫橘小实蝇中,注射200μM花生四烯酸后胞吞相关基因的表达,如chc、rab7、arf72a、ap50和vha-sfd,也较注射DMSO的对照组中均出现了40%-57%的上调。之前的研究表明果蝇中喂食ds RNA不能诱导RNAi效应,根据上面的结果,我们将花生四烯酸注射进果蝇然后喂食ds RNA,发现靶标基因下调了44%。免疫荧光染色的结果也表明注射花生四烯酸后,ds RNA分子能顺利进入果蝇肠道细胞内。3.转录组和蛋白组的研究发现脂肪酸合成代谢通路在橘小实蝇RNAi免疫耐受中起重要的调控作用。我们分别将对照组和免疫组橘小实蝇的早期和晚期样本进行了转录组和蛋白组分析,筛选差异表达的基因和蛋白。早期样本中免疫组相较于对照组共有1204个基因和72个蛋白表达量上调,1343个基因和43个蛋白的表达量下调;晚期样本中免疫组相较于对照组有844个基因和68个蛋白表达上调,1119个基因和79个蛋白表达下调。对测序得到的差异表达基因和蛋白的结果进行GO富集分析结果表明在生物学过程分类中,早期差异表达的基因和蛋白富集到了265个GO条目,分为14簇,包括生长发育、大分子代谢以及脂肪酸代谢等生物学过程;晚期样本的差异表达基因和蛋白富集到了132个GO条目,分为12簇,包括磷脂代谢,跨膜运输,含氮化合物代谢等生物学过程。结合代谢组、转录组与蛋白组的结果我们发现脂肪酸合成与代谢通路对橘小实蝇RNAi免疫耐受起重要的调控作用。我们选取了该通路上的关键基因fasn,利用―RNAi of RNAi‖的方法检测该基因在橘小实蝇对RNAi的免疫耐受中的作用。干扰fasn后喂食ds-rpl19,并于5 d后第二次喂食ds RNA,结果显示,fasn干扰组目的基因表达量下调了50%,而对照组则在第二次喂食ds RNA后未出现明显的RNAi效应。4.脂肪酸合成代谢通路上编码脂肪酸延伸酶ELOVL6的关键基因noa调控橘小实蝇体液免疫通路的启动。我们克隆得到的橘小实蝇noa基因全长1608 bp,包括990 bp的开放阅读框,编码包含329个氨基酸的蛋白。表达模式的研究结果表明noa基因在各个发育时期均有表达,其中胚胎期表达最高;在我们检测的不同组织中,noa在精巢中的相对表达量最高,其次是卵巢。利用RNAi干扰noa基因的表达后,我们检测到Toll通路上的My D88和defensin分别在喂食ds-noa后第2 d和第4 d出现最大50%和74%的下调;Imd通路上的realish和diptericin的表达在noa干扰后第2 d出现最大分别为63%和65%的下调。并且单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)感染橘小实蝇后,noa基因的表达量会出现上调。喂食ds-noa后分别注射L.monocytogenes和S.aureus,My D88和defensin在注射菌液后6 h、12 h和24 h的表达均较喂食ds-egfp再注射菌液的对照组有显著下调。而干扰noa之后注射L.monocytogenes和E.coli,realish和diptericin的表达在注射病原菌后6 h、12 h和24h相较于ds-egfp组有显著降低。并且注射L.monocytogenes后,ds-egfp组致死中时间(MTD)约为4 d,而ds-noa组注射菌液后MTD减少为2 d。这些结果表明干扰noa会影响橘小实蝇体液免疫通路Toll/Imd的启动,显著降低其对病原菌感染的抵抗力。