论文部分内容阅读
研究背景与研究目的:过敏性鼻炎是一种常见的上呼吸道慢性炎症疾病,表现为连续的喷嚏,清水样鼻涕,鼻塞及鼻痒等。全世界约有5亿人群正受其困扰。过敏性鼻炎不仅严重影响患者的生活质量和工作效率,而且长期的药物治疗给患者也带来诸多的各种不良反应及经济负担。目前临床上尚无有效药物用于该病的治疗,此外,患者抗药性的产生及对药物耐受也严重影响其治疗效果。因此,寻找一种更安全有效的用于过敏性鼻炎的治疗方案具有重要意义。近年来的研究证实,间充质干细胞（MSCs）及其分泌的外泌体有免疫抑制作用,是治疗过敏性鼻炎的一种很有前途的治疗方法。脐带间充质干细胞（UCMSCs）具有增殖能力强、免疫源性低、没有伦理障碍及无致/成瘤性等特点,是治疗多种疾病的理想干细胞来源。然而UCMSCs长期体外扩增可降低其分化潜能和免疫调节功能。越来越多的研究表明,模拟干细胞治疗时所处的体内环境（即低氧状态）可以提高其生存能力,促进细胞增殖及维持其干细胞特征。本文旨在探讨长期低氧处理对UCMSCs特征的影响以及低氧处理UCMSCs分泌的外泌体在治疗过敏性鼻炎中的作用及其机制。实验方法:1.人UCMSCs的分离、培养及鉴定:利用组织贴壁法从人脐带分离及培养UCMSCs,并在常氧或低氧条件下比较UCMSCs的下述特征:1)细胞计数及端粒酶活性分析检测UCMSCs扩增能力;2)流式细胞术检测UCMSCs的表面分子标志物;3)成脂、成骨及成软骨分化实验检测UCMSCs的体外多向分化潜能;4)软琼脂集落形成实验检测UCMSCs的致瘤性;5)G-带分析检测UCMSCs的染色体核型。2.UCMSCs来源的条件培养液（conditional medium,CM）及外泌体（exosomes）的制备、鉴定及成分分析:在常氧或低氧条件下对UCMSCs进行培养,常规方法制备CM和外泌体,并比较常氧或低氧条件下CM或外泌体的下述特征:1)利用Elisa检测CM中可溶性细胞因子TGFβ、IL-10、TNFα、IL-6及IL-1β的含量;2)利用超高速离心法分离UCMSC-CM中的外泌体;3)利用小分子RNA测序分析外泌体内mi RNA的含量及差异表达;4)利用GO及KEGG通路富集方法分析mi RMA差异表达的主要生物学功能。3.长期低氧培养UCMSCs分泌的CM或外泌体对小鼠过敏性鼻炎的治疗作用及机制研究:1)利用OVA建立小鼠过敏性鼻炎模型;2)行为学观察统计小鼠挠鼻和打喷嚏数量;3)利用HE染色检测小鼠鼻黏膜组织炎性细胞浸润及组织重塑情况;4)利用Q-PCR检测鼻黏膜组织T-bet、Foxp3、Gata3及IL-4、IL-10的表达。4.长期低氧培养UCMSCs分泌的外泌体对树突状细胞（DC）功能的影响及机制分析:1)利用连续贴壁法诱导分离人外周血单核细胞来源的未成熟DC;2)利用OVA+LPS刺激未成熟（im DC）DC分化成成熟DC（m DC）,同时检测外泌体对DC分化成熟的影响,用IL-10和TGFβ诱导未成熟DC分化成耐受型DC作为对照,3)细胞流式分析CD11c、HLA-DR双阳性m DC比例,以及共刺激分子CD80、CD40、CD86和CD83的表达量。实验结果:1.长期低氧处理可促进UCMSCs的增殖和分化,并抑制细胞衰老:1)贴壁法分离的UCMSCs呈梭形,整体细胞为漩涡状;2)细胞计数及端粒酶活性分析表明,低氧预处理可促进UCMSCs增殖;3)半乳糖苷酶染色表明,低氧处理可抑制UCMSCs衰老;4)流式细胞检测表明,UCMSCs高表达CD105、CD44、CD73、CD90,不表达CD34、CD45和HLA-DR;5)UCMSCs可在体外定向分化为骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞;6)Q-PCR检测表明,低氧处理有利于维持UCMSCs的干性基因OCT4、Sox2及Nanog的表达;7)软琼脂克隆实验表明,低氧处理条件下,UCMSCs培至P20代无成/致瘤作用;8)G带分析表明,UCMSCs在低氧条件下培养至P20代其核型正常。2.低氧预处理UCMSCs后分泌的CM对OVA-诱导的小鼠过敏性鼻炎具有较强的治疗作用,其机制与其降低鼻黏膜组织Th1、Th2和Treg侵润有关:1)小鼠挠鼻和打喷嚏行为学观察表明,相比正常氧,低氧预处理UCMSCs后分泌的CM可显著改善小鼠过敏性鼻炎症状;2)HE染色表明,低氧预处理UCMSCs后分泌的CM可显著抑制鼻黏膜组织炎性细胞浸润和组织重塑;3)Elisa检测表明,低氧预处理UCMSCs后分泌的CM可显著降低血清总Ig E含量;4)Q-PCR检测表明,正常氧处理UCMSCs后分泌的CM可抑制Gata3和IL-4的表达,促进T-bet、Foxp3和IL-10的表达,而低氧预处理UCMSCs后分泌的CM则可抑制Gata3、T-bet、Foxp3、IL-4和IL-10的表达。3.低氧预处理UCMSCs对CM的可溶性细胞因子含量无明显影响,但可影响其外泌体的mi RNA含量及表达谱:1)Elisa检测表明低氧及正常氧培养UCMSCs对CM的可溶性细胞因子含量无明显差异;2)外泌体mi RNA测序表明,低氧预处理可影响UCMSCs分泌的外泌体mi RNA表达谱;3)GO及KEGG信号通路富集分析表明,其差异表达的mi RNA主要影响T淋巴细胞共刺激信号通路。4.低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体可增强对小鼠过敏性鼻炎的治疗效果:1)低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体显著改善小鼠过敏性鼻炎症状;2)HE染色表明低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体显著抑制鼻黏膜组织炎性细胞浸润和组织重塑;3)Q-PCR检测表明,正常氧处理UCMSCs后分泌的外泌体可抑制IL-4表达,促进IL-10表达,而低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体则可抑制IL-4和IL-10表达。5.低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体可抑制体外DC细胞的分化成熟和共刺激分子的表达:流式细胞检测表明,低氧预处理UCMSC后分泌的外泌体显著降低CD11c+HLA-DR+阳性细胞比例及抑制共刺激分子CD40和CD80的表达。结论:1.低氧预处理可增强UCMSCs的扩增和分化能力,促进间充质干细胞标志基因的表达、对其不表达造血干细胞相关基因、低免疫原性及不致瘤等特征没有影响;2.低氧预处理可以促进UCMSCs外分泌物包括CM和外泌体对OVA诱导小鼠过敏性鼻炎的治疗作用;3.低氧预处理可通过改变UCMSCs外泌体的mi RNA含量及表达谱增强对OVA诱导小鼠过敏性鼻炎的治疗作用;4.低氧预处理UCMSCs后分泌的外泌体可抑制DC细胞的分化成熟和共刺激分子的表达,进而增强其对OVA诱导小鼠过敏性鼻炎的治疗作用。