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研究目的:体外探讨外源性腺苷分别对成骨细胞形成和破骨细胞形成的影响以及相关的分子机制,接着制备搭载有腺苷的聚己内酯（polycaprolactone,PCL）/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）同轴静电纺丝纳米纤维膜,通过该载药系统中腺苷的缓释,在促进大鼠颅骨缺损愈合的同时减少腺苷药物副作用的产生。材料和方法:应用CCK8实验分析不同浓度的外源性腺苷、S3I-201（一种STAT3特异性抑制剂）以及ZM241385（一种A2AR特异性抑制剂）的细胞毒性作用。茜素红染色、Real-time PCR以及Western blot用来观察腺苷对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨能力的影响以及S3I-201对于腺苷介导的BMSCs成骨向分化的影响。BMSCs经腺苷作用后,在加入或不加入S3I-201的情况下,通过免疫荧光染色及Western blot检测细胞中磷酸化STAT3的表达变化。大鼠骨髓巨噬细胞（BMMs）经M-CSF和RANKL诱导破骨分化,加入腺苷后进行TRAP染色,观察其对BMMs分化形成破骨细胞的影响。在RAW264.7细胞经RANKL诱导破骨向分化的过程中加入腺苷,并在加入或不加入ZM241385的情况下,通过TRAP染色和Von Kossa染色分别检测破骨细胞的形成情况和骨吸收能力,通过Real-time PCR检测细胞中破骨细胞相关基因Ctsk、NFATc1、MMP9和ACP5,以及腺苷受体基因A1R、A2AR、A2BR和A3R的m RNA水平表达情况。RNA-seq全基因组分析用来检测及定位腺苷在影响RANKL诱导RAW264.7细胞破骨分化过程中起作用的关键信号分子,接着通过Real-time PCR、Western blot以及免疫荧光染色对其进行验证。搭载有腺苷的PCL/PVA纳米纤维膜通过同轴静电纺丝技术制备完成。扫描电子显微镜（SEM）及共聚焦激光扫描荧光显微镜（纤维核层和壳层分别经钙黄绿素和罗丹明B预染）用来观察纤维膜的形态结构。拉力试验机用来测量纤维膜的应力-应变强度。水滴形分析系统用来检测它们的动态水接触角。在与大鼠BMSCs共培养后,活-死染色用来评估纤维膜的生物相容性,SEM用来观察细胞在纤维膜上的生长形态。高效液相色谱分析用来在体外测定PCL/PVA载药纳米纤维膜中腺苷的释放量。最后,建立SD大鼠临界性颅骨缺损模型,将PCL/PVA纤维膜（对照）与载有腺苷的PCL/PVA纤维膜覆盖在与纤维膜同等大小的颅骨缺损上,观测它们对缺损愈合的影响。电力实验系统用来监测大鼠的收缩压及心率。全自动生化仪用来测定大鼠丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶等肝功能相关的生化指标。Micro-CT、HE染色、Masson三色染色和免疫组织化学染色用来评价缺损处的骨再生情况。结果:CCK8实验结果表明不同浓度的外源性腺苷（15、30、60、120μg/ml）均不具有明显的细胞毒性作用,但茜素红染色表明腺苷体外诱导大鼠BMSCs形成矿化结节的最佳浓度为60μg/ml。Western blot结果表明,腺苷（60μg/ml）能促进BMSCs中磷酸化STAT3蛋白水平的表达,而加入S3I-201（100μM）后表达明显降低。此外,免疫荧光染色和茜素红染色结果分别表明,S3I-201能明显抑制BMSCs中腺苷引起的磷酸化STAT3的入核表达以及矿化结节形成。同样,在Real-time PCR结果中,腺苷能明显促进BMSCs中成骨细胞相关基因ALP、Col1、Osterix及Runx2 m RNA水平的表达,这一过程能被S3I-201阻断。这些标记物在蛋白水平的表达与m RNA水平表达的趋势一致。TRAP染色结果显示,腺苷（60μg/ml）能抑制大鼠BMMs经M-CSF和RANKL刺激后的破骨向分化,减少成熟破骨细胞的形成,同时CCK8实验表明其能促进该细胞的增殖。TRAP染色结果显示,腺苷（60μg/ml）也能显著抑制RAW264.7细胞经RANKL诱导后破骨细胞的形成。与RANKL共培养的RAW264.7细胞在加入腺苷刺激后,A2AR的m RNA表达升高,同时破骨细胞相关基因Ctsk、NFATc1、MMP9和ACP5的m RNA表达降低,而在加入ZM241385（1μM）后,这些基因的表达趋势发生逆转。同样地,经腺苷作用后,RAW264.7细胞中RANKL引起的破骨细胞形成以及破骨吸收功能均受到抑制,而在加入ZM241385后上述情况发生逆转。RAW264.7细胞DEG表达热图及样本聚类分析得出,与RANKL组相比,RANKL+腺苷组中Fra2基因表达水平明显降低。Real-time PCR进一步验证了这一结果,且在RANKL+腺苷组中加入ZM241385后,Fra2的表达又重新升高。此外,Fra2蛋白及荧光水平的表达与其m RNA水平的表达趋势相近。扫描电镜观察得出,腺苷（Ade）与PVA质量比为0.3:0.4的PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）同轴纳米纤维膜较其它比例的纤维膜在纤维直径的分布上最为均匀。在共聚焦激光扫描显微镜下可以看到显现绿色的PVA或者Ade-PVA核层均匀的分布在显现红色的PCL/PVA及PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）纳米纤维壳层中心。应力-应变曲线显示,对比PCL/PVA组,PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）组拉伸强度明显增加,达到7.1±1.33Mpa。而在水接触角的测量结果中,它们并没有统计学差异。将大鼠BMSCs植入两种纤维膜上后,尽管细胞活-死染色结果显示这两种纤维膜都显现绿色,但扫描电镜观察发现,PCL/PVA膜上的细胞表现出异常的纺锤状,而PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）膜上的细胞则表现出BMSCs正常的多角形。高效液相色谱检测结果表明,PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）纳米纤维膜能在体外持续性缓释腺苷长达60天。在SD大鼠临界性颅骨缺损模型中分别应用两种纳米纤维膜后,与PCL/PVA组相比,PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）组在术后4周和8周都能更好地促进缺损处的骨再生及Col1的表达,而在同时腹腔注射S3I-201（10mg/kg,两天一次）的大鼠中,这种促进作用明显受到抑制。这与体外将PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）纳米纤维膜与大鼠BMSCs共培养后的茜素红染色结果相一致。除此之外,系统注射腺苷带来的大鼠低血压及心率降低等副作用,在本次应用PCL/Ade-PVA（0.3/0.4）纳米纤维药物缓释膜的大鼠中并没有出现。结论:本次研究发现,腺苷能通过激活STAT3信号通路促进大鼠BMSCs的成骨向分化,同时抑制大鼠BMMs的破骨向分化并促进其增殖。此外,腺苷能与A2AR结合通过下调Fra2抑制RAW264.7细胞中RANKL诱导的破骨细胞形成。最后,PCL/PVA同轴静电纺丝膜是一种有效的腺苷载药缓释系统,通过持久缓释腺苷促进骨缺损的愈合,同时也避免了腺苷系统性给药带来的不良副作用,如低血压及心动过缓。