抑郁症作为一种常见的精神疾病,严重影响人们的生活和工作,危害人们的的身体健康,但是由于抗抑郁西药的副作用及用药后作用效果较差的原因,抑郁症的治疗直至今日仍是世界研究的热点,逍遥散作为疏肝解郁治法的经典治疗情志类疾病的复方,其抗抑郁的机制需要研究和探讨。目的:验证疏肝解郁方药逍遥散是否可通过调控慢性应激损伤海马神经细胞GR入核活性和FKBP4、FKBP5表达,上调BDNF表达,改善其海马神经可塑性。揭示疏肝解郁治法通过调控神经可塑性,发挥抗应激损伤效应的相关分子生物学机制。方法:实验一(动物实验)1、将成年雄性WISTAR大鼠随机分为正常组、模型组、逍遥散低剂量组、逍遥散中剂量、逍遥散高剂量组、米非司酮组,采用连续21天慢性轻度不可预见性应激建立大鼠抑郁模型;2、观测逍遥散对抑郁模型大鼠行为学和糖水消耗的影响;3、通过HE染色观测逍遥散对抑郁模型大鼠海马CA3区锥体细胞的形态结构、数目的影响;4、通过ELISA法检测血清皮质酮;5、运用免疫组化方法研究逍遥散对抑郁模型大鼠海马CA3区锥体细胞GR、BDNF、FKBP4和FKBP51的影响;6、运用RT-PCR法观测逍遥散对抑郁模型大鼠海马中GR、BDNF与FKBP4/FKBP51的mRNA表达的影响。7、运用Westem-blot法观测海实验方法研究逍遥散对抑郁模型大鼠海马马中GR、BDNF、FKBP4和FKBP51的总蛋白。实验二(细胞实验)1、进行海马神经细胞的培养,并同时观察不同浓度皮质酮浓度的损伤情况和米非司酮的保护情况;2、将培养好的神经细胞分为空白对照组、脑脊液组、皮质酮组、皮质酮+低剂量含药脑脊液组、皮质酮+中剂量含药脑脊液组、皮质酮+高剂量含药脑脊液组和皮质酮+RU-38486组;3、运用流式细胞术观察逍遥散对神经细胞增殖及凋亡的影响;4、运用RT-PCR法观测逍遥散对海马神经元中GR、BDNF与FKBP4/FKBP51的mRNA表达的影响;5、运用Westem-blot法观测海实验方法研究逍遥散对大鼠海马神经元中GR、BDNF与FKBP4/FKBP51的总蛋白及细胞质与细胞核中GR蛋白表达量的影响;6、通过免疫共沉定观察FKBP4和FKBP51与GR的结合情况;7、通过免疫双荧光观察FKBP4和FKBP51对GR反应元件的影响。实验三(逍遥散复方研究)1、观察逍遥散的高效液相的分离情况;2、观察逍遥散样品的相似性。结果:实验一(动物实验)1、模型组大鼠活动路程减少,休息时间延长与空白对照组比较有明显差异(P<0.05)。逍遥散各组与模型组相比活动路程、活跃度高于对照组,休息时间低于对照组,统计学有明显差异(P<0.05);2、模型组大鼠糖水偏好度下降,与空白对照组相比有明显差异(P<0.05)。中药低中高各组及米非司酮组大鼠的糖水偏好度提高,有明显差异(P<0.05);3、在光镜下,模型对照组与正常对照组大鼠细胞海马CA3区锥体细胞相比明显减少(P<0.05)。在使用高剂量逍遥散和米非司酮后,抑郁大鼠细胞海马CA3区锥体细胞数目明显升高,与模型对照组相比其数目升高有统计学意义(P<0.05);4、免疫组化和HE染色阳性细胞计数显示与空白对照组比较,抑郁模型组BDNF阳性细胞明显减少,而逍遥散药物及米非司酮明显改善了这一状况,BDNF阳性细胞数明显增加(P<0.05)。模型组GR、FKBP4的阳性细胞较空白对照组明显减少,而高剂量逍遥散和米非司酮却使阳性细胞数明显增加(P<0.05)。模型组FKBP51阳性细胞较空白对照组明显增加,而高剂量逍遥散和米非司酮明显减少FKBP51阳性细胞计数;5、定量实时PCR测定的结果显示,与空白对照相比,模型对照组大鼠中GR,BDNF,FKBP4mRNA水平显著降低,FKBP51mRNA水平显著增加。与模型对照组相比,逍遥散显著上调GR,BDNF,FKBP4 mRNA水平和下调FKBP51 mRNA水平(P<0.05);6、Western—blot结果显示与空白对照相比,模型对照组大鼠中GR,BDNF,FKBP4平均光密度值降低,FKBP51平均光密度值增加。与模型对照组相比,逍遥散显著上调GR,BDNF,FKBP4平均光密度值和下调FKBP51平均光密度值(P<0.05)。实验二(细胞实验)1、通过MTT法检测,最佳皮质酮浓度为(IC50)223μmol/L;最佳RU-38486保护浓度为2.078μmol/L;2、MTT结果表明,与脑脊液组相比,皮质酮使用后神经细胞的存活率显著降低(P<0.01);3、逍遥散脑脊髓液及阳性药物RU-38486对细胞的活力有明显的提高作用(P<0.05),暴露于皮质酮的海马神经细胞表现出神经变性的特征,包括失去突触。而逍遥散可以减少突触的伤害。4;流式细胞术结果表明,皮质酮显著降低细胞存活率,逍遥散和RU38486可以提高与皮质酮组相比的速率。皮质酮处理后G0/G1和G2/M期的细胞DNA含量增加,而S期的细胞DNA含量在处理后降低。逍遥散减少G0/G1和G2/M期的细胞DNA含量,并增加S期的细胞DNA含量;皮质酮显著增加细胞凋亡,与皮质酮组相比逍遥散和RU38486可降低凋亡细胞的速率;5、免疫荧光检测结果显示,脑脊液组与对照组之间GR(绿色荧光)的核至胞质易位没有显著性差异(P>0.05)。与脑脊液组组相比,皮质酮组GR明显增加。皮质酮组与逍遥散组RU38486组相比,逍遥散和RU38486降低了 GR的核易位,相应的增加了GR在细胞膜的数量(P<0.05);6、定量实时PCR测定的结果显示GR,BDNF和FKBP4 mRNA水平显著降低,与空白对照组相比皮质酮组海马神经元中的FKBP51mRNA水平显著增加(P<0.05),与皮质酮相比逍遥散和RU38486组中,GR,BDNF,FKBP4 mRNA水平显著增加,FKBP51 mRNA水平显著降低(P<0.05);7、Western印迹结果显示与脑脊液组组比较皮质酮组GR,BDNF和FKBP4的蛋白水平显著下调,FKBP51蛋白表达显著上调(P<0.05)。与皮质酮组相比逍遥散和RU38486组GR,BDNF,FKBP4和FKBP51的蛋白水平反转,并有明显差异(P<0.05);8、Western印迹结果显示,皮质酮组的GR表达在细胞质与细胞核都明显低于空白对照组,但逍遥散和RU-38486明显提高了GR在细胞质与细胞核的表达(P<0.05);9、EMSA电泳显示结果表明FKBP4与GR结合,而FKBP51不与GR结合。10、双荧光素酶基因报道分析的结果表明FKBP4可以以剂量依赖性方式显著增加GRE转录活性(P<0.05或P<0.01),FKBP51显著降低GRE转录活性(P<0.01)。实验三(逍遥散复方研究)逍遥散的高效液相色谱(HPLC)实现了优异的分离,其中芍药苷,甘草苷,阿魏酸和甘草酸的含量分别为21.53mg/g,5.32mg/g,4.56mg/g和6.41mg/g,且9个样品的所有相似性值大于0.95。结论:逍遥散可以改善应激大鼠的行为学的表现和应激损伤的海马神经元。逍遥散可以通过提高FKBP4的表达,降低FKBP51的表达,调控GR的入核活性,降低血GC的浓度,实现对海马神经元的保护。