随着我国草坪业的快速发展，草坪草遗传育种工作越来越受到人们关注，生物技术在草坪草品种改良中具有很大的应用潜力。干旱和高盐是限制草坪草生长的主要环境因子，当前我国特别缺乏抗旱耐盐的草坪草品种。利用植物基因工程技术，克隆并转化抗旱耐盐基因，使其在草坪草中表达，可以明显加快耐盐抗旱新品种的选育，具有广阔的应用前景。拟南芥液泡质子焦磷酸酶Arabidopsis Vacuolar H~+-Pyrophosphatase(AVP1)通过调节液泡膜两侧的质子梯度，控制植物生长激素的运输，随之影响依赖生长素的各种发育事件，使植物在高盐和干旱胁迫下产生适应性。拟南芥rd29A(Responsive to Dehydration，rd29A)启动子是胁迫诱导型启动子，能在干旱、低温和高盐条件驱动下游基因表达。本文运用农杆菌介导法将从拟南芥中克隆的AVP1基因转入匍匐翦股颖，在诱导型的rd29A启动子驱动下进行表达，并对获得的转基因匍匐翦股颖进行抗旱耐盐生理测定，获得了抗旱耐盐性增强的草坪草。主要实验结果如下：1、建立了草坪草的愈伤组织遗传转化受体系统。以冷季型草坪草匍匐翦股颖和高羊茅的种子作为外植体，愈伤组织诱导率分别为53.0±8.7％和60.7±7.9％，均能诱导产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织生长稳定，继代一个月后生长速率可达206.0±43.7％和159.3±34.4％。而暖季型草坪草狗牙根以种子作为外植体的愈伤组织诱导率仅为14.7±4.0％，且只产生非胚性愈伤组织，该愈伤组织生长速率为78.4±23.2％；以狗牙根的节作为外植体可以诱导出胚性愈伤组织，但数次继代后转为非胚性愈伤组织。2、通过农杆菌介导法将rd29A启动子驱动AVP1基因的pCambia1302表达载体转入匍匐翦股颖。分别用浓度为50、75、100mg/L潮霉素筛选转化愈伤组织，三种浓度的筛选率为64.1±5.0％、81.5±1.5％和33.3±3.8％。经过一个半月的筛选，50mg/L潮霉素筛选后的转化愈伤的hpt-PCR阳性植株比率仅为0.9％，75mg/L浓度下的分化植株hpt-PCR阳性比率高达96.7％。因此，确定75mg/L为匍匐翦股颖转化愈伤的最佳筛选浓度。3、转基因匍匐翦股颖植株的PCR鉴定。获得再生匍匐翦股颖植株90株，其中hpt-PCR阳性株87株，阳性比率为96.7％；AVP1-PCR阳性株13株，阳性比率为14/4％。4、转基因匍匐翦股颖愈伤组织中AVP1基因表达的RT—PCR检测。结果显示，在正常培养条件下转基因愈伤AVP1基因微量表达，而在干旱(干燥48h)、低温(4℃，24h)或高盐(200mM NaCl)胁迫下AVP1基因的表达均明显增强；未转基因的野生型材料中，无论处理与否均未检测到AVP1基因的表达。该结果表明在非胁迫条件下rd29A启动子的活性很低，而在干旱、低温或高盐处理条件下活性明显增强，从而启动其下游基因AVP1的表达。由此验证了干旱、低温和高盐条件能促进转基因匍匐翦股颖中目的基因AVP1的表达水平。5、转基因匍匐翦股颖愈伤组织的抗性生理分析。经干燥处理2天和3天后，转基因愈伤组织的恢复生长速率为645％和543％，野生型的为423％和135％，可见转基因匍匐翦股颖比野生型具有更强的耐旱性；在高盐胁迫下，用0-200 mM不同浓度NaCl处理的转基因愈伤，其生长速率均高于相同情况下的野生型愈伤。尤其是在NaCl浓度分别为50mmol/L，200mmol/L时两者的差异较大，分别相差170％和148％。表明转AVP1基因的匍匐翦股颖的高盐耐受性增强。6、转基因匍匐翦股颖植株的抗性生理分析。经过9天的干旱胁迫后，转基因翦股颖小苗叶片为鲜绿色，而野生型草叶片则明显萎焉变黄。对干旱处理前后小苗相对含水量进行测定，干旱处理前转基因和野生型翦股颖小苗的含水量差异不明显，而干旱胁迫后转基因翦股颖的含水量为82.6％，明显高于野生型的77.5％，说明转基因匍匐翦股颖比野生型耐旱。转基因植株根的生物量测定结果显示，转基因植株根的干重平均为0.17±0.02g，而野生型植株平均只有0.07±0.01g，两者差异明显。此结果表明转基因植株具有发达的根系，有利于植物吸取土壤中的水份和养分，增强对干旱的耐受性。