背景与目的肺结核是我国重大传染病之一,并已被列入“国家科技重大专项-艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治-中医药防治肺结核综合研究”项目中。但是迄今为止,尚未见肺结核病完整的中医证侯规律及中西医结合治疗方案的研究。亦未见中医药治疗肺结核病的大宗系统的病例报导,对引起肺结核的病原学-抗酸杆菌属结核分枝杆菌的鉴定需时长(约48天以上),繁琐,不便指导临床治疗。为此,本文旨在研究肺结核病的中医证侯规律及中西医结合治疗方案以完善肺结核病的中医证侯分型和治疗方案,并探讨病原学鉴定的新技术(PCR-RLB技术),以加快病原学的鉴定,提高其灵敏性及准确性。从而为肺结核病的防治提供理论依据和实验依据。本文共分为三部分来进行研究。第一部分初治继发性肺结核病中医证侯规律的探讨(此为“国家科技重大专项-中医药防治肺结核综合研究”项目,课题编号：2008ZX10005-010)。第二部分养阴清肺方联合西药治疗初治涂阳继发性肺结核病的临床观察。第三部分聚合酶链反应-反向线点杂交技术鉴定分枝杆菌的方法学研究及临床应用。第一部分初治继发性肺结核病中医证侯规律的探讨研究内容1.收集2009年3月-2009年11月在深圳市第三人民医院肺科病区住院及门诊就诊符合纳入标准的患者,共100例。先按照望、闻、问、切顺序采集,然后统一用舌诊仪、脉诊仪采集舌、脉。四诊采集均由一名中医专科医师专职观察并填写调查表.一名中医主任医师指导。根据制定的中医证侯诊断标准进行辨证分型。2.统计方法：采用SPSS统计软件进行统计分析,计数资料用卡方检验。研究结果1.100例初治继发性肺结核中医症状发生例数：咳嗽伴无力5例,咳嗽伴声低2例,呛咳气急3例,咳声短促67例,气短声低1例；咳嗽痰少80例,咳痰粘黄稠15例,痰白清稀5例；咯血血色鲜红14例；午后低热21例,午后潮热2例,手足心热67例；盗汗94例,自汗3例,自汗盗汗并见3例；午后颧红3例；胸部隐隐作痛15例,胸胁掣痛3例,胸闷3例；小便黄87例；大便干结81例；形体消瘦13例；失眠11例,纳呆7例；神疲6例；乏力6例；口干咽燥4例；头晕4例；畏风3例；气短懒言3例；便溏2例；腰膝酸软2例；急躁易怒1例；口苦咽干1例；男子遗精1例；女子经少或经闭1例；手足不温1例；腹胀1例；面色苍白1例；面色萎黄1例。2.100例初治继发性肺结核舌象、脉象的发生例数：舌质：舌质红60例,舌红少津12例,舌光淡边有齿痕3例；舌红而干20例,舌质淡5例。舌苔：少苔2例,苔薄黄91例,苔黄腻3例；苔白4例。脉象：脉细数67例,脉细22例,脉细弱而数3例,脉滑数3例,脉弦数1例,脉虚弱3例,脉细弱1例。3.100例初治继发性肺结核中医辨证分型：根据中医证侯辨证标准将100例患者进行辨证分型,其中肺阴亏虚证67例,阴虚火旺证20例,气阴两虚证3例,肺脾气虚证1例,肺肾阴虚证2例,肺气虚证3例,肝火犯肺证1例,痰热蕴肺证3例。肺阴虚证的发生率(67%)明显高于其他证型(P＜0.01),其次为阴虚火旺证(20%)的发生率也高于除肺阴亏虚证外的其他证型(P＜0.01)。第二部分养阴清肺法联合西药治疗初治痰涂片找抗酸杆菌阳性继发性肺结核病的临床观察。研究内容1.收集2009年3月-2009年11月在深圳市第三人民医院肺科病区住院并符合纳入标准的患者,共76例。按奇偶数序贯分组法(奇数为对照组,偶数为治疗组)分为治疗组和对照组,每组各38例。对照组采用2HRZE/4HR。治疗组为西药(同对照组治疗方案)+养阴清肺方,共治疗2周。治疗前及治疗后分别观察临床症状观察指标及评分(咳嗽、盗汗、手足心热、胸部隐痛、痰中带血丝、口燥咽干、痰少等)；痰菌涂片抗酸染色观察菌量；DR胸部正位片观察病灶范围、空洞数；疗效观察；不良反应的发生率。2.统计方法：采用SPSS统计软件进行统计分析,计量资料采用t检验,计数资料用卡方检验。研究结果1.治疗组与对照组治疗前基本情况的比较：将符合治疗方案纳入标准的病例共76例,按奇偶序贯的原则分为治疗组和对照组,其中治疗组38例,对照组38例。两组在年龄、性别、体重、症状评分、病程、痰菌涂片抗酸染色评分、DR胸片、有无合并病、分枝杆菌鉴定比较无显著性差异,具有可比性。2.治疗组与对照组治疗前后症状评分的比较：治疗组与对照组治疗后症状评分均较治疗前有改善(P<0.05)；治疗后治疗组评分稍低于对照组,但两者之间无显著性差异(P>0.05)。3.治疗组与对照组治疗前后痰菌涂片抗酸染色评分比较：治疗组与对照组治疗后抗酸染色评分均较治疗前稍下降,但无显著性差异(P>O.05)；治疗后两组间抗酸染色评分比较无显著性差异(P>O.05)。4.治疗组与对照组治疗前后胸片的比较：治疗组与对照组治疗后胸片的病灶范围、空洞数较治疗前均无变化。5.治疗组与对照组的治疗疗效比较：治疗组与对照组经2周治疗总好转率达到100%,主要表现在临床表现明显改善,而痰涂片及培养无明显变化,而胸片也无明显改善。治疗组与对照组在总有效率方面无显著性差异(P>0.05)。6.治疗组与对照组治疗后不良反应发生率比较：治疗组中1例和对照组中2例均出现肝功受损,均仅表现为ALT、AST升高,最高值为正常上限的2倍(80U/L)以内,胆红素正常,无临床症状,给予1周护肝治疗后均恢复正常；治疗组中1例和对照组中2例均出现恶心、呕吐的胃肠反应,均将利福平改为饭后服用,胃肠反应的症状消失；对照组中1例出现全身皮疹、瘙痒的表现,停用异烟肼后症状逐渐消失,治疗组无过敏性皮炎发生；治疗组与对照组均未出现肾功异常、视神经炎、末梢神经炎、痛风关节炎的不良反应。治疗组与对照组在不良反应发生率上无显著性差异(P>0.05)。第三部分聚合酶链反应-反向线点杂交技术鉴定分枝杆菌的方法学研究及临床应用材料与方法1.实验一PCR-反向线点杂交技术检测鉴定34种分枝杆菌标准株及临床分离株设计并制备引物和探针,将42株(40种)分枝杆菌标准株和546株临床分离株分别按步骤进行制作膜芯片、DNA的提取,PCR扩增产物、反向线点杂交、气相色谱法、高效液相色谱法,PCR产物直接测序,根据分枝杆菌标准株与PCR-RLB反应情况,比较PCR-RLB探针的特异性；用超纯水稀释结核分枝杆菌H37Rv菌液为0.5麦氏单位,提取DNA,再按500pg/μl,50pg/μl,5pg/μl,500fg/μl,50fg/μl进行系列稀释,PCR扩增,扩增产物PCR-RLB反应,观察尼龙膜显影斑点的强弱,来判断结核分枝杆菌探针的敏感性；通过比较PCR-RLB鉴定结果、GC鉴定结果、HPLC鉴定结果、DNA直接测序结果,分析PCR-RLB实验在鉴定分枝杆菌种属、亚型和混合感染方面的特异性。2.实验二PCR-反向线点杂交技术快速同时检测和鉴定分枝杆菌的临床应用收集771份临床标本,每份临床标本再分4小份,分别按步骤进行涂片找抗酸杆菌、分枝杆菌培养鉴定、荧光定量聚合酶链反应、DNA提取、反向线点杂交、PCR产物直接测序。通过比较结核分枝杆菌FQ-PCR定量结果与PCR-RLB鉴定结果,来了解DNA含量与PCR-RLB实验之间的关系；通过比较传统培养鉴定结果、DNA直接测序和PCR-RLB鉴定结果,分析PCR-RLB实验的临床特异性；通过比较涂片找抗酸杆菌结果、培养鉴定结果、FQ-PCR定量结果和PCR-RLB鉴定结果,来对PCR-RLB实验的阳性率进行比较。同时比较分枝杆菌培养鉴定与杂交鉴定各需时间,分析结果。研究结果1.实验一PCR-反向线点杂交技术检测鉴定34种分枝杆菌标准株及临床分离株1.1 PCR-RLB引物和探针的特异性：所有分枝杆菌种均与相对应的分枝杆菌发生反应,但由于海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的16S-23S rRNA基因间隔片段相同,所以海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌之间存在交叉反应；塞内加尔分枝杆菌可与FOR1探针(偶然分枝杆菌a/c和塞内加尔分枝杆菌)发生杂交反应,而偶然分枝杆菌与SEN探针(塞内加尔分枝杆菌)却不发生杂交反应,PCR-RLB实验可以鉴别龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌,但结核分枝杆菌复合群中的菌种无法鉴别,如图1。1.2 PCR-RLB探针的敏感性：结核分枝杆菌标准株菌液浓度为500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、时,PCR-RLB均可见阳性反应,当浓度为500fg/μl、时,尼龙膜上显影点隐约可见,呈弱阳性,当浓度为50fg/μl、时,尼龙膜上未见显影,判断结核分枝杆菌探针敏感性为500fg/μl。1.3 PCR-RLB鉴定临床分离株：结核分枝杆菌复合群菌株共312株,其中GC鉴定245株,HPLC鉴定67株,均提示为结核分枝杆菌复合群,PCR-RLB鉴定结果提示除1株为瘰疬分枝杆菌,与GC结果不一致外,其余均为结核分枝杆菌复合群,此株经DNA测序证实为瘰疬分枝杆菌；鸟分枝杆菌复合群共5株,GC鉴定提示5株均为鸟分枝杆菌复合群,而PCR-RLB鉴定结果提示5株为胞内分枝杆菌,与DNA直接测序结果一致；鸟分枝杆菌共39株,经HPLC鉴定39株均为鸟分枝杆菌,而PCR-RLB鉴定18株为鸟分枝杆菌,与DNA测序结果一致,17株为胞内分枝杆菌,与测序结果一致,4株为鸟分枝杆菌混合堪萨斯分枝杆菌a/b, DNA序列无法判读；经GC鉴定提示龟-脓肿分枝杆菌复合群28株,经PCR-RLB鉴定26株为脓肿分枝杆菌,1株为龟分枝杆菌a/b,1株为龟分枝杆菌c,DNA测序结果提示2株为龟分枝杆菌；经HPLC鉴定龟分枝杆菌4株,经PCR-RLB鉴定3株为龟分枝杆菌a/b, DNA测序结果为龟分枝杆菌,1株为龟分枝杆菌混合偶然分枝杆菌感染,DNA测序结果无法判读；偶然分枝杆菌共29株,其中GC鉴定22株均为偶然分枝杆菌,余7株经HPLC鉴定为偶然分枝杆菌,PCR-RLB鉴定结果同GC和HPLC结果；经GC鉴定12株为草分枝杆菌,与PCR-RLB鉴定结果相同；经HPLC鉴定4株为胞内分枝杆菌,PCR-RLB鉴定2株为鸟分枝杆菌,2株为胞内分枝杆菌,与DNA测序结果一致；瘰疬分枝杆菌共30株,其中GC鉴定16株均为瘰疬分枝杆菌,而PCR-RLB鉴定14株为瘰疬分枝杆菌,2株为瘰疬分枝杆菌混合胞内分枝杆菌,此2株经DNA测序,序列无法判读,余14株经HPLC鉴定与PCR-RLB结果一致,均为瘰疬分枝杆菌；经HPLC鉴定2株为耻垢分枝杆菌,同PCR-RLB结果一致；堪萨斯分枝杆菌共6株,其中GC鉴定2株为堪萨斯分枝杆菌,而PCR-RLB鉴定为堪萨斯分枝杆菌a/b,余4株HPLC鉴定为堪萨斯分枝杆菌,而PCR-RLB鉴定2株为堪萨斯分枝杆菌a/b,2株为堪萨斯分枝杆菌c；DNA测序鉴定均为堪萨斯分枝杆菌；经HPLC鉴定2株为溃疡分枝杆菌,PCR-RLB鉴定为海/溃疡分枝杆菌,DNA测序为溃疡分枝杆菌；戈登分枝杆菌共51株,其中经GC鉴定36株,而PCR-RLB鉴定31株为戈登分枝杆菌,3株为混合脓肿分枝杆菌,2株为混合偶然分枝杆菌,此5株经DNA测序结果无法判读；15株经HPLC和PCR-RLB鉴定均为戈登分枝杆菌；4株经HPLC、PCR-RLB和DNA测序鉴定均为三重分枝杆菌；2株经HPLC、PCR-RLB和DNA测序鉴定均为马尔摩分枝杆菌；2株经HPLC、PCR-RLB和DNA测序鉴定均为蟾分枝杆菌；2株经HPLC、PCR-RLB和DNA测序鉴定均为苏尔加分枝杆菌；4株经HPLC、PCR-RLB和DNA测序鉴定均为缓黄分枝杆菌；8株经PCR-RLB和DNA测序鉴定均为麻风分枝杆菌。2.实验二PCR-反向线点杂交技术快速同时检测和鉴定分枝杆菌的临床应用2.1 PCR-RLB探针敏感性：将鉴定为结核分枝杆菌复合群标本的FQ-PCR结果和PCR-RLB结果进行比较,DNA定量在5×102-1×104拷贝/ml组的标本PCR-RLB实验均未见阳性反应,DNA定量在1×104-1×105拷贝/ml组的标本中,49.8%的标本PCR-RLB实验可见阳性反应,明显高于DNA定量在5×102-1×104拷贝/ml组(x2=64.9,P<0.01),而DNA定量在1×105-2.3×108拷贝/ml的标本则均可在PCR-RLB实验中见阳性反应,明显高于DNA定量在1×104-1×105拷贝/ml组(x1=68.46,P<0.01)。2.2 PCR-RLB的特异性比较：将传统培养鉴定结果、PCR-RLB鉴定结果、DNA测序结果进行比较,PCR-RLB共鉴定出35株非结核分枝杆菌,与传统培养鉴定结果一致；35个标本中PCR-RLB鉴定鸟分枝杆菌7株,与DNA测序结果一致；胞内分枝杆菌8株,与PCR产物测序结果一致；脓肿分枝杆菌12株,与DNA测序结果一致；堪萨斯分枝杆菌3株,2株为堪萨斯分枝杆菌a/b,1株为堪萨斯分枝杆菌c,而测序结果为3株堪萨斯分枝杆菌。戈登分枝杆菌2株,龟分枝杆菌1株,偶然分枝杆菌2株,均与测序结果一致。2.3临床标本阳性率比较：将PCR-RLB鉴定结果与涂片找抗酸杆菌结果、分枝杆菌培养结果和FQ-PCR结果进行比较阳性率。PCR-RLB鉴定阳性率39.8%,明显高于涂片找抗酸杆菌阳性率21.4%(x2=61.57,P<0.01)，与培养结果阳性率35.7%无显著性差异(x2=2.65,P>0.05),但明显低于FQ-PCR阳性率65.9%(x2=13.67,P<0.01)。2.4传统培养鉴定方法与PCR-RLB方法耗费时间的比较：传统培养分枝杆菌方法联合PNB生长试验和TCH生长试验平均所用时间为48-56天,而PCR-RLB方法鉴定分枝杆菌仅需1天,明显短于传统方法。研究结论通过研究我们初治继发性肺结核病人中医辨证多为肺阴亏虚证(67%)和阴虚火旺证(20%),明显高与其他证型。这与传统的中医认识是一致的,也与我们对肺结核中医症状发生率、舌象、脉象结果保持一致。根据第一部分研究结果,我们选择中医辨证最常见的证侯,以养阴清肺法治疗初治涂阳继发性肺结核肺阴亏虚证的患者38例,发现其短期疗效优于单纯西药治疗,并且无特殊不良反应发生。本PCR-RLB实验是根据16S-23S rRNA基因间隔序列为靶序列设计的引物和探针,经过建立PCR-RLB实验、优化条件,及与分枝杆菌标准株和临床分离株杂交,证实其特异性和敏感性,通过与临床标本直接杂交,并与涂片、培养、TB-DNA定量比较,证实本实验方法具有敏感、特异性高,快速等特点,值得临床推广。