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灰飞虱(Laodelphax striatellus)和褐飞虱(Nilaparvata lugens)均是水稻上的重要害虫,它不仅可以刺吸水稻造成虫害,而且还可以传毒引发水稻病毒病,给农业造成巨大损失。同时,长期使用化学药剂防治使它们的抗药性日渐增强,因此需要研究和开发新的稻飞虱防治技术。基因干扰(RNAi)不但可以用于研究基因的功能,还可以沉默靶标基因干扰生物的特定生命过程,故可以为害虫防治提供了新的可能途径。但要实现害虫的基因干扰防控,首先必须解决昆虫基因干扰的效率和环境安全问题。因此,本研究选择在其他生物RNAi中具有重要功能的2种dsRNA结合蛋白TRBP和STAU,克隆了稻飞虱体内的同源基因,通过喂食dsRNA勺方法研究确定它们在稻飞虱RNAi过程中是否起作用,进而寻找可能影响害虫基因干扰效应的关键因子,为高效利用RNAi技术进行害虫防治提供理论依据。现将研究结果总结如下：1.稻飞虱2种dsRNA结合蛋白基因的克隆根据其他生物dsRNA结合蛋白TRBP和STAU的基因序列,在稻飞虱转录组数据中进行同源搜索,依据搜索到的基因设计特异引物,扩增出稻飞虱中TRBP和STAU的同源基因片段。此后利用5’RACE和3’RACE技术,克隆获得了灰飞虱这两个基因的全长序列,分别命名为LsTRBP和LsSTAU。它们的长度分别为2548bp和2650bp,在GenBank中登录号分别为JN882650和JN882649。序列分析结果表明,这两个基因均包含1个开放阅读框,其中TRBP编码339氨基酸,其编码蛋白理论上的等电点PI=8.86,分子质量为37.1kDa,STAU编码743氨基酸,其编码蛋白理论上的等电点PI=9.26,分子质量为81.2kDa,两种基因均具有特征性dsRNA结合结构域。系统发育分析显示,它们与其他生物同源基因的相似性聚类与物种进化关系密切相关,在现有的分析基因中,与赤拟谷盗体内的同源基因相似性最高。2.灰飞虱dsRNA结合蛋白TRBP的功能研究通过喂食dsRNA研究了TRBP基因在稻飞虱体内RNAi过程中的作用。首先根据前期研究成果选取几丁质酶基因(Chi)这一具有高效致死干扰效应的基因作为指示基因,然后根据预试及前期研究确定的相关条件进行喂食干扰实验。结果发现,灰飞虱单独喂食dsChi可以产生显著的致死效应(21.2%),校正死亡率是dsEGFP处理对照(5.2%)的4.1倍；单独喂食dsTRBP (5.6%)没有明显的致死效应；同时喂食dsChi和dsTRBP时(2.3%),也没有致死效应。表明干扰LsTRBP基因,可以显著降低Chi基因的干扰效果,不仅说明灰飞虱LsTRBP基因是调控基因干扰的重要功能蛋白,同时也说明灰飞虱基因干扰过程中dsRNA的代谢调控机制与高等动物类似。3、灰飞虱dsRNA结合蛋白STAU的功能研究通过喂食dsRNA研究了STAU基因在稻飞虱体内RNAi过程中的作用。同样选取几丁质酶基因(Chi)作为指示基因,进行喂食干扰实验。实验结果与dsTRBP处理有明显不同,灰飞虱单独喂食dsChi可以产生显著的致死效应(21.2%),单独喂食dsSTAU(6.9%)也没有明显的致死效应；同时喂食dsChi和dsSTAU时(16.7%),致死效应仍较高,与dsChi处理没有显著差异,表明同时喂食dsSTAU+dsChi干扰灰飞虱STAU基因,并不影响dsChi的干扰效应。4、褐飞虱2种dsRNA结合蛋白基因的功能研究通过喂食dsRNA进一步研究了TRBP和STAU基因在褐飞虱体内RNAi过程中的作用。同研究灰飞虱的一样,选取褐飞虱的几丁质酶基因(Chi)作为指示基因,根据相关文献中的褐飞虱RNAi条件进行喂食干扰实验。结果发现,褐飞虱单独喂食dsChi同样可以产生显著的致死效应(45.2%),校正死亡率是dsEGFP处理对照(7.1%)的6.4倍；单独喂食dsTRBP (11.9%)或dsSTAU (12.7%)与dsEGFP处理的致死效应没有显著差异；同时喂食dsChi和dsTRBP (18.6%)时,试虫校正死亡率明显低于单独喂食dsChi的,同时喂食dsChi和dsSTAU (35.8%)时,有明显的致死效应。检测相关目标基因表达量发现,在褐飞虱中干扰TRBP基因,会影响Chi基因的干扰效果；而干扰STAU基因,STAU基因表达量差异没有导致dsChi的致死效应的差异,表明dsRNA结合蛋白STAU不会影响RNA干扰过程,与灰飞虱的结果一致。综上所述,本研究通过转录组数据搜索和PCR验证,证实2种飞虱体内均存在dsRNA结合蛋白TRBP和STAU的同源基因,同时成功克隆了灰飞虱这2个基因的全长,通过基因干扰试验证实TRBP基因是调控基因干扰的重要功能蛋白,稻飞虱基因干扰过程中dsRNA的代谢调控机制与高等动物类似,STAU对RNAi沉默效应的影响不同于TRBP,其作用机制尚需进一步研究。以上结果为进一步研究昆虫RNAi作用机制,开发安全高效的RNAi害虫防控技术奠定了良好的工作基础。