肥胖与2型糖尿病关系密切，其共同的病理生理特征是：胰岛素抵抗(InsulinResistance，IR)。但肥胖如何导致IR，从而引起2型糖尿病的发生？其根本机制尚未完全明了。 脂肪组织可释放多种脂肪因子，参与调节糖脂代谢和胰岛素的敏感性。抵抗素在啮齿类动物中也是一种脂肪分泌因子，在体内的试验表明输注抵抗素后能极显著增加肝糖输出及损害肝脏胰岛素作用，而特异的抵抗素反义寡脱氧核苷酸却能抑制这种效应，其主要机理是通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMP—activatedproteinkinase，AMPK)磷酸化，上调糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖—6-磷酸酶(G6Pase)的表达。抵抗素导致啮齿类动物胰岛素抵抗已得到广泛认可。 然而，抵抗素在人类的作用还存在争议，因为人抵抗素同小鼠的抵抗素在氨基酸水平上只有59％的同源性，而且其来源也不同，人抵抗素主要来源于外周血的单核巨噬细胞。有关人类抵抗素表达水平与肥胖、糖尿病、脂代谢紊乱之间相关性的在体研究并未得出一致的结论：部分结果支持抵抗素与IR相关，但另外一些结果显示抵抗素与IR无关。目前对人抵抗素的体外研究资料较少，且主要集中在内皮细胞及单核巨噬细胞，而对胰岛素敏感的靶细胞如肝细胞、脂肪细胞或骨骼肌细胞的代谢是否受人抵抗素影响及其相关机制的有关报道更少。 AMPK是细胞内总的能量敏感器，是由两个α亚单位(α1、α2)、两个β亚单位(β1、β2)和3个γ亚单位(γ1、γ2、γ3)构成的异三聚体，其中α亚基起催化作用，β和γ亚基在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用。AMPK的调节主要涉及别构调节和磷酸化修饰，其中AMPKα亚基172位苏氨酸的磷酸化是维持其活性所必需，且只有AMPKα2的活性才与胰岛素敏感性相关联。AMPK作为机体重要的蛋白激酶，能够调节糖、脂、蛋白质三大物质代谢及其相关基因的表达，是与2型糖尿病密切相关的主要物质。 肝脏胰岛素抵抗是2型糖尿病重要病理生理基础之一。大量的实验显示抵抗素在啮齿类动物可通过抑制AMPK磷酸化导致肝脏IR，本实验室前期的研究也通过重组腺病毒构建高抵抗素血症的小鼠模型证实了这一点。那么在人类抵抗素是否会损伤肝细胞糖脂代谢，其机制是否也是通过AMPK通路介导？AMPK通路与胰岛素信号通路之间的关系如何？迄今为止有关报道很少。为此我们对人抵抗素在肝细胞糖脂代谢中的作用及其机制进行了初步探讨。 在本课题中我们应用重组人抵抗素(以下简称人抵抗素)处理人肝细胞株HepG2细胞，同时采用siRNA技术抑制HepG2细胞AMPKα2的表达，观察人抵抗素对HepG2细胞糖脂代谢的影响及其作用机制。本课题研究的主要目的在于：①人抵抗素是否对HepG2细胞的葡萄糖代谢产生影响？如果有影响，将进一步阐明其机制是否依赖AMPK途径。②人抵抗素是否对HepG2细胞的脂质代谢产生影响？如果有影响，将进一步阐明其机制是否依赖AMPK途径？③人抵抗素对HepG2细胞胰岛素信号通路是否有影响？胰岛素信号通路与AMPK通路之间的关系如何？ 依据研究目的，本课题研究内容主要包括四个部分： 1.采用siRNA技术抑制AMPKα2在HepG2细胞中的表达。 2.探讨人抵抗素对HepG2细胞葡萄糖代谢的影响及其相关机制。 3.模拟体内较高浓度的游离饱和脂肪酸的环境，探讨人抵抗素对HepG2细胞脂质代谢的影响及其相关机制。 4.探讨人抵抗素对HepG2细胞胰岛素信号通路的影响。 第一部分siRNA抑制HepG2细胞AMPKα2基因的表达研究 目的:利用siRNA技术抑制HepG2细胞AMPKα2基因的表达 小结:本研究利用化学合成的21nt的AMPKα2siRNA，通过优化转染条件，利用反向转染法导入HepG2细胞24h后，AMPKα2mRNA及蛋白表达抑制率分别为52.3±0.8％及48.1±2.3％，可有效地降解AMPKα2mRNA并抑制其蛋白表达，这一作用持续72小时以上，为进一步研究人抵抗素是否通过AMPK通路影响HepG2细胞的糖脂代谢打下实验基础。 第二部分抵抗素对HepG2细胞葡萄糖代谢的影响及其与AMPK通路的关系 目的:探讨人抵抗素对HepG2细胞葡萄糖代谢影响及其与AMPK通路的关系。 小结： 　　1.人抵抗素在基础状态下以剂量依赖方式降低HepG2细胞AMPK磷酸化水平，在基础及胰岛素刺激状态下降低AMPKα2 mRNA的表达及AMPK磷酸化水平；应用AMPKα2 siRNA可使AMPKα2 mRNA的表达及AMPK磷酸化水平进一步降低。 　　2.人抵抗素可影响HepG2细胞的葡萄糖代谢：下调HepG2细胞GLUT—2 mRNA的表达，上调糖异生关键酶G6Pase、PEPCK mRNA表达，并使肝糖原合成减少。 　　3.人抵抗素可通过AMPK通路影响HepG2细胞葡萄糖代谢。 第三部分抵抗素对HepG2细胞脂质代谢的影响及其与AMPK通路的关系 目的:探讨人抵抗素对HepG2细胞脂肪代谢影响及其与AMPK通路的关系。 小结： 　　1.在高浓度的游离饱和脂肪酸环境中，在基础及胰岛素刺激状态下人抵抗素可降低HepG2细胞AMPKα2 mRNA的表达及AMPK磷酸化水平；应用AMPKα2siRNA可使AMPKα2 mRNA的表达及AMPK磷酸化水平进一步降低。 　　2.人抵抗素可影响HepG2细胞的脂质代谢：增加胞膜脂肪酸转位酶CD36含量，上调ACC2、SREBP1 mRNA的表达以及降低ACC1(Ser79)蛋白磷酸化水平，使ACC活性增加，下调肝脂肪酶HL mRNA的表达，并使HepG2细胞内脂肪含量增加。 　　3.人抵抗素可通过AMPK通路影响HepG2细胞脂质代谢。 第四部分抵抗素对HepG2细胞胰岛素信号通路的影响 目的:探讨人抵抗素对HepG2细胞胰岛素PI3K/Akt信号通路的影响及PI3K/Akt通路与AMPK通路与之间的关系。 小结： 　　1.人抵抗素上调HepG2细胞SOCS—3 mRNA表达，下调IRS—2 mRNA表达、减低Akt的蛋白量及降低Akt磷酸化水平。人抵抗素对HepG2细胞胰岛素PI3K—Akt通路的这一影响可能与其导致肝脏胰岛素抵抗的机制有关。 　　2.人抵抗素对HepG2细胞AMPK通路与胰岛素PI3K—Akt通路的影响可以相互独立。