蓝藻发菜几个适应陆生环境基因的转录因子筛选

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陆生蓝藻发菜适应复杂干旱-半干旱极端陆生环境的分子机制尚不是十分清楚。本实验以陆生耐旱蓝藻发菜为研究对象,在本实验室已完成陆生蓝藻发菜的全基因组测序并对相关抗逆分子有一定研究的基础上,参与完成发菜转录因子文库的建立,并进行发菜抗逆基因的转录因子筛选以及信号传导机制研究,为研究发菜耐受极端逆境的信号转导途径提供前期研究基础。基于实验室已有抗逆组分的研究,本研究选取发菜抗逆基因:伪枝藻素合成基因、MAA合成基因、wspa、psbA以及nblA等17个基因。通过启动子预测网站和软件进行生物信息学分析,选取基因编码区上游非编码片段,构建pAbAi重组质粒并转入Y1H Gold酵母菌株中。通过酵母单杂交筛选获得发菜抗逆基因的转录因子,并重新在酵母中进行点对点验证。在大肠杆菌中诱导表达获得转录因子纯化蛋白,在体外进行电泳迁移率变动分析(EMSA)实验进一步验证发菜抗逆基因启动子与转录因子的相互作用,结果发现psbA启动子与COO9100964有强相互作用;wspa启动子与COO9106020相互作用;伪枝藻素合成基因簇启动子与COO9106020相互作用。在此基础之上,截短wspa和伪枝藻素合成基因簇的上游非编码区域,通过EMSA竞争实验确认最小有效区段;MAAs合成基因COO9106028的启动子、MAAs合成基因簇的转录因子OrrA可与转录因子COO9103874相互作用;COO9101675作为调控蛋白可以负调控转录因子COO9103874与MAAs基因簇启动子的结合能力。Wspa和伪枝藻素基因簇的启动子区与转录因子COO9106020相互作用,推测转录因子COO9106020可能在发菜响应干旱、紫外等信号通路中发挥重要作用;筛选获得的调控蛋白COO9101675可以负向调控MAAs基因簇中的COO9106028基因启动子区与转录因子COO9103246的相互作用,推测发菜中的信号转导机制除典型的双组分系统外存在更为复杂的调控机制。发菜中的抗逆响应机制及信号传导机制有待进一步研究。
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