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肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是一种恶性度高,死亡率高的消化系统肿瘤。淋巴道转移是影响肝癌临床预后的一个首要的决定因素,所以解析肝癌淋巴道转移的分子机制对肝癌诊治有着重要的指导意义。尽管在治疗方法上有了很大改进,但是目前临床可用的预测肝癌转移的有效的肿瘤标志物仍然缺少。因此,探求肝癌转移有关标志蛋白,寻求其分子机制已经成为肝癌相关转化医学研究的重心。Hca-F和Hca-P是本课题组多年前克隆筛选分离的来源于同一亲本的拥有不同转移潜能的小鼠肝癌腹水型细胞。Hca-F为淋巴结转移率>70%的高淋巴道转移潜能细胞;Hca-P为淋巴结转移率<30%的低淋巴道转移潜能细胞,因此是研究肝癌淋巴道转移机制互为参照,良好、实用的细胞系模型。本实验室在前期研究中,利用多种分子生物学技术发现Hca-F细胞和Hca-P细胞的十多种基因,在基因和蛋白质水平都有显著差异性表达,其中包括膜联蛋白A7(Annexin A7,Anxa7)、凝溶胶蛋白(Gelsolin,Gsn)和半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)等在内,进而推测AnnexinA7等基因很可能在小鼠肝癌的淋巴道转移过程中发挥着非常重要的作用。尽管淋巴结转移的前提条件是新生淋巴管生成,VEGF-C作为调控淋巴管生成的特异因子及其与淋巴结转移的相关性在动物实验及临床病理实验中已经获得证明,但关于AnnexinA7、VEGF-C等基因在肿瘤转移至淋巴结过程中是否具有协同作用的研究鲜有报道。血清是获得肿瘤标志物的理想来源,也是临床早期发现、早期诊断恶性肿瘤的重要可能检测对象。虽然血清VEGF-C表达水平的检测在肝癌转移中的意义已经明确,但其在肝癌细胞上清液、组织内和AnnexinA7血清学的检测研究尚未见有报道,特别是有关血清Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD蛋白等的变化与肝癌淋巴道转移的相关性及其机制,经检索也几乎没有发现有类似的研究报告发表,这也为我们进一步工作深入探讨留下了空间。因此,本课题在前期实验研究结果的基础上,综合利用一系列体外、体内方法研究AnnexinA7调控肝癌侵袭转移的分子机制,进一步探测肿瘤动物模型体内肝癌侵袭转移相关的AnnexinA7、VEGF-C、Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD细胞学、组织学和血清学靶分子的改变,并论证此类特征性变化是否有可能作为实时监测指标及其对于肿瘤诊治或许具有的潜在重要意义。第一部分小鼠肝癌Hca-P细胞Annexin A7表达调控对体外培养肿瘤细胞VEGF-C表达的影响目的:研究VEGF-C在小鼠肝癌细胞株Hca-P稳定转染Annexin A7后在体外的表达变化。方法:利用体外肿瘤细胞培养技术,提取Hca-P、PAnxa7上调细胞、 PAnxa7下调细胞及PAnxa7无关序列细胞的RNA和蛋白质;应用qRT-PCR和Western blot方法,分别在mRNA和蛋白质水平检测上述各组细胞VEGF-C的表达变化;应用ELISA方法,检测上述各组细胞上清液中VEGF-C蛋白表达含量。结果:体外实验表明,1:以PAnxa7无关序列细胞组作为阴性对照,PAnxa7下调细胞中Annexin A7/VEGF-C基因表达水平分别是对照组的0.51倍和1.86倍;PAnxa7上调细胞中AnnexinA7/VEGF-C基因表达水平分别是对照组的1.96倍和0.46倍。2:AnnexinA7基因表达下调后,Annexin A7蛋白表达降低42%,VEGF-C蛋白表达增加70%;Annexin A7基因表达上调后, Annexin A7蛋白表达增加32%,VEGF-C蛋白表达降低55%。3:ELISA实验结果表明,PAnxa7下调细胞上清液中,VEGF-C蛋白的表达明显增加;PAnxa7上调细胞上清液中,VEGF-C蛋白表达明显减少;Hca-P和PAnxa7-无关序列细胞上清液中,VEGF-C蛋白表达无差异。结论:1. Annexin A7基因上调后减少了VEGF-C在体外培养肿瘤细胞中的表达与分泌,有可能降低小鼠肝癌淋巴道转移潜能2. Annexin A7基因下调后增加了VEGF-C在体外培养肿瘤细胞中的表达与分泌,有可能促进小鼠肝癌淋巴道转移潜能。第二部分小鼠肝癌Hca-P细胞稳定转染Annexin A7后对动物肿瘤模型体内VEGF-C表达的动态变化目的:利用动物肿瘤模型进行体内实验,研究AnnexinA7和VEGF-C在原发瘤及血清中的动态变化,探讨其作为预测小鼠肝癌淋巴道转移标志物的意义。方法:收集Hca-F、Hca-P、PAnxa7上调细胞及PAnxa7下调细胞,将四组细胞分别接种到615小鼠足垫,建立肿瘤淋巴道转移模型,并且持续观察测量肿瘤大小至第8周;采用HE染色、Western Blot和ELISA等方法,检测AnnexinA7基因上调和下调表达后,其在第2至第8周荷瘤小鼠体内淋巴结转移率的变化;每周一次连续8周抽血,检测原发瘤和血清中AnnexinA7和VEGF-C的动态变化,对比研究两基因在肿瘤淋巴道转移机制及其检测中可能具有的潜在重要意义。结果:1.Hca-F和PAnxa7下调组出现淋巴道转移最早都在第三周;Hca-P组在第四周出现淋巴道转移; PAnxa7上调细胞组出现淋巴道转移在第五周才出现。2.四组原发瘤中Annexin A7蛋白表达逐渐降低,VEGF-C蛋白表达逐渐增高;除了PAnxa7下调组,其它三组肿瘤组织中AnnexinA7和VEGF-C蛋白的动态表达分别和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能都表现为负相关和正相关。3.四组荷瘤动物中血清Annexin A7/VEGF-C的表达水平均高于正常对照小鼠血清;以肿瘤细胞接种到小鼠足垫之时起计算,血清Annexin A7的表达在四组肿瘤出现转移前都会出现短暂性增高;随着肿瘤进展转移潜能增强,四组荷瘤动物中血清Annexin A7/VEGF-C的表达都逐步增高;四组荷瘤动物中血清AnnexinA7的动态表达和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能、血清VEGF-C的动态表达都表现为正相关。四组荷瘤动物中血清VEGF-C的动态表达和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能都表现为正相关。结论:1. Annexin A7和VEGF-C在原发瘤表达呈现相反的趋势。2.血清VEGF-C水平的升高可以预示肿瘤的发生。VEGF-C表达可能单独作为小鼠肝癌淋巴道转移组织学和血清学的标志物。3.血清Annexin A7水平的升高可以预示肿瘤的发生。血清AnnexinA7可能单独或联合VEGF-C的共同表达,作为小鼠肝癌淋巴道转移血清学监测的标志物。第三部分小鼠肝癌Hca-P细胞稳定转染AnnexinA7后对体外培养肿瘤细胞Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD表达的影响目的:研究Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD在小鼠肝癌细胞株Hca-P稳定转染AnnexinA7后在体内的表达变化。方法:利用体外肿瘤细胞培养技术,收集提取Hca-P、PAnxa7上调细胞及PAnxa7无关序列细胞株的RNA和蛋白质,应用qRT-PCR和Western blot技术,分别在mRNA和蛋白质水平检测Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD的表达变化。结果:体外实验表明,以PAnxa7无关序列细胞组作为阴性对照,PAnxa7上调细胞中Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD基因表达水平都增高,分别是对照组的1.51倍、1.83倍、1.62倍和1.91倍;AnnexinA7基因表达上调后,Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD蛋白表达分别增加53%、81%、38%和51%。结论: AnnexinA7基因上调后增加了Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD在体外培养肿瘤细胞中的表达,有可能降低小鼠肝癌淋巴道转移潜能。第四部分小鼠肝癌Hca-P细胞稳定转染Annexin A7后对Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD表达的动态变化目的:利用动物肿瘤模型进行体内实验,研究AnnexinA7表达调控后Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD在小鼠肝癌淋巴道转移发展过程中原发瘤和血清中的动态表达变化,对比研究上述基因在肿瘤淋巴道转移机制及其检测中可能具有的潜在重要意义。方法:将Hca-F、Hca-P、PAnxa7上调细胞及PAnxa7下调细胞分别接种到615小鼠足垫,建立肿瘤淋巴道转移模型;采用HE染色、Western Blot和ELISA等方法,检测AnnexinA7基因上调和下调表达后,其在第2至第8周淋巴结转移率的变化;同时观察Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD在此期间内原发瘤中的动态变化;每周一次连续8周抽血,检测血清中的Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD的动态变化。结果:1.Gelsolin、Galectin-3蛋白表达在Hca-F和Hca-P组原发瘤中动态表达变化不明显;PAnxa7上调组都呈现逐渐增高的趋势;PAnxa7下调组都呈现逐渐降低的趋势。四组原发瘤中ALG-2蛋白表达都呈现波动状态;SODD蛋白在第三周开始在Hca-F组原发瘤中出现表达;在第四周开始在Hca-P组原发瘤中出现表达;在第二周开始在PAnxa7上调组原发瘤中表达;在第四周开始在PAnxa7下调组原发瘤中出现表达。2.四组原发瘤中只有在PAnxa7上调组肿瘤组织中Gelsolin和Galectin-3蛋白的动态表达分别和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能都表现为正相关,其它三组都无关;只有在Hca-F组和Hca-P组,肿瘤组织中SODD蛋白的动态表达和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能表现为正相关,其它两组都无关。3.四组荷瘤动物中血清Gelsolin、Galectin-3的表达水平均高于正常对照小鼠血清;正常对照小鼠血清都没有检测到ALG-2和SODD的表达,随着肿瘤进展转移潜能增强,四组荷瘤动物中血清Gelsolin、Galectin-3、ALG-2和SODD的表达都逐步增高。除了PAnxa7上调组,Hca-F、Hca-P和PAnxa7下调组血清SODD的出现都和其相应淋巴道出现转移的时间相吻合。4.四组荷瘤动物中只有在PAnxa7上调组血清Gelsolin、Galectin-3的动态表达分别和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能、血清AnnexinA7动态表达之间都表现为正相关,其它三组都无关。5.四组荷瘤动物中血清ALG-2的动态表达分别和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能、血清AnnexinA7动态表达和血清VEGF-C动态表达之间都表现为正相关。6.四组荷瘤动物中只有在PAnxa7上调和PAnxa7下调组,血清SODD的动态表达分别和相应的小鼠肝癌淋巴道转移潜能、血清AnnexinA7动态表达和血清VEGF-C动态表达之间都表现为正相关,其它二组都无关。结论:1.血清Gelsolin、Galectin-3水平的升高可以预示肿瘤的发生。Gelsolin、Galectin-3可能要联合AnnexinA7的共同表达作为小鼠肝癌淋巴道转移组织学和血清学的标志物。2.血清ALG-2水平的升高可以预示肿瘤的发生。ALG-2可能单独或联合AnnexinA7、VEGF-C的共同表达作为小鼠肝癌淋巴道转移血清学的标志物;ALG-2表达可能单独作为小鼠肝癌淋巴道转移组织学的标志物。3.血清SODD水平的升高可以预示肿瘤的发生和转移。SODD可能联合AnnexinA7、VEGF-C的共同表达作为小鼠肝癌淋巴道转移血清学的标志物;SODD表达可能单独作为小鼠肝癌淋巴道转移组织学的标志物。