目的:　　1.观察miRNA-21/101/125a/195/200b在肝硬化-肝癌中的表达变化;　　2.选择差异显著的miRNA-101，并阐述在实验性肝纤维化中的作用;　　3.基于mTOR信号分子探讨复肝丸调控miRNA-101的抗肝纤维化作用机制。　　方法:　　该论文分为三部分。　　第一部分:　　为了解miRNA-21/101/125a/195/200b在肝纤维化/肝硬化、肝癌中的研究进展，检索在线数据库pubmed、Web of Science、中国知网(CNKI)。根据医学主题词表(MeSH)，限定检索关键词为①“Liver Fibrosis”or“Hepatic fibrosis”or“Liver Cirrhosis” or“Hepatic Cirrhosis”and“microRNA” or“miRNA”;“肝纤维化”或者“肝硬化”并且“microRNA”或者“miRNA”②“Hepatocellular Carcinoma” or“Liver Cancer”and“microRNA” or“miRNA”;“肝癌”并且“microRNA”或者“miRNA”。分别检索上述5个miRNA，检索日期截至2016年4月1日。　　收集2014年9月至2015年8月，于我院肝胆外科行手术治疗的患者肝组织样本，其中血管瘤样本6例、肝硬化样本10例，肝癌及癌旁组织14对;血管瘤患者HBsAg(-)，肝硬化、肝癌患者均为HBsAg(+)。采用PCR技术检测各组患者肝组织中miR-21、miR-101、miR-125a、miR-195、miR-200b的表达。采用Pearson相关性分析探索miR-101表达与临床相应指标之间的相关性。　　第二部分:　　制备人源性肝细胞HL-7702过氧化损伤模型、肝星状细胞LX-2活化模型、肝窦内皮细胞HHSEC增殖模型，检测miR-101在不同模型中的表达变化;进一步检测miR-101在小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞JS-1中的表达变化。将miR-101模拟物(mimic)/抑制剂(inhibitor)分别转染LX-2细胞以观察其转染效率;采用Cell Counting Kit8(CCK8)检测miR-101mimic对LX-2细胞的毒性，及其对转化生长因子-β1（TGF-β1，5ng/mL）诱导的LX-2细胞的抑制情况;PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF, CCN2)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)的mRNA表达水平。通过在线数据库TargetScan、miRDB、microRNA.org对miR-101的靶基因进行预测，取三个数据库交集（18个）、已验证靶基因（15个）以及与肝纤维化关系密切的基因（27个），并在LX-2细胞水平进行PCR Array分析。进一步观察上述差异表达基因在miR-101 inhibitor及TGF-β1模型中的表达变化。　　第三部分:　　(1)体外部分:采用CCK8评价复肝丸对LX-2细胞及大鼠原代肝星状细胞的毒性，进而观察复肝丸对TGF-β1诱导的HSC的抑制效果，以SB431542(TGFβRⅠ抑制剂，20μM)为阳性对照;CCK8评价复肝丸对HL-7702细胞及大鼠原代肝细胞的毒性，进一步观察复肝丸对过氧化氢(H2O2，0.5mM)诱导的肝细胞损伤的保护作用，以N-乙酰半胱氨酸(NAC，15mM)为阳性对照。PCR检测不同浓度复肝丸对α-SMA及miR-101表达的影响。分别采用EdU掺入法、绿色荧光探针检测低、中、高剂量复肝丸与miR-101 mimic联用对LX-2细胞增殖、F-actin表达的影响。采用Western blot检测药物对细胞内磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B（Akt）、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70核蛋白S6激酶(p70s6k)蛋白表达的影响。　　结果:　　第一部分:　　检索肝纤维化/肝硬化研究中符合上述条件的文献，关于miR-21得到7篇、miR-101得到2篇、miR-125a得到3篇、miR-195与miR-200b均得到0篇;检索肝癌研究中符合上述条件的文献，关于miR-21得到27篇、miR-101得到12篇、miR-125a得到7篇、miR-195得到6篇、miR-200b得到3篇。　　对临床资料进行描述，与对照组相比，肝硬化组血小板(PLT)明显降低，凝血酶原时间(PT)延长、国际标准化比值(INR)升高，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(T.Bil)升高;HE染色、Masson染色及网状纤维染色显示，肝硬化组肝小叶结构排列紊乱，纤维组织增生伴假小叶形成，汇管区大量炎细胞浸润，小叶内部分肝细胞胞质疏松水肿，可见毛玻璃样变性。与肝硬化组相比，肝癌组白细胞(WBC)、PLT均有所升高，PT、INR降低，AST、T.Bil表达下降;与对照组、肝硬化组相比，肝癌组甲胎蛋白(AFP)表达显著升高。免疫组化见肝癌组肝细胞抗原(+)、AFP(+)，Ki-67表达显著升高，提示癌细胞增殖活跃;癌旁组织可见假小叶形成，网状支架塌陷。　　PCR检测5个miRNA在上述各组中的表达，与对照组相比，miR-101、miR-195在肝硬化组中的表达下降;与癌旁组织相比，miR-21在肝癌中的表达升高，miR-101、miR-195的表达则显著降低。miR-125a、miR-200b的表达在各组间无明显变化。Pearson相关性分析观察miR-101表达与患者年龄、RBC、WBC、PLT、PT、INR、AST、T.Bil、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、AFP、糖类抗原19-9(CA19-9)之间的相关性，发现miR-101与PLT表达水平呈正相关，相关系数为0.375。　　第二部分:　　TGF-β1诱导的LX-2细胞活化模型中miR-101的表达出现特征性降低。该趋势在四氯化碳（carbol tetrachloride，CCl4）诱导的小鼠肝纤维化组织及活化的JS-1细胞中得到进一步验证，表明miR-101的表达变化与HSC活化有关。分别将不同浓度的miR-101 mimic/inhibitor转染至LX-2细胞，发现50bM的mimic、100nM的inhibitor可显著促进或抑制miR-101的表达。CCK8结果显示，与模拟物阴性对照(mimic NC)相比，miR-101mimic对LX-2细胞无明显毒性，并可抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化，降低α-SMA、CCN2、ColⅠ mRNA表达水平。根据PCR Array结果选择SOX9、FOS、MCL1、EZH2、TGFβRⅠ、mTOR基因，并将miR-101 inhibitor转染LX-2细胞来进一步验证。与抑制剂阴性对照（inhibitor NC）相比，miR-101 inhibitor组EZH2、mTOR的表达显著升高，且miR-101 mimic可显著抑制TGF-β1活化的LX-2细胞中mTOR的表达。　　第三部分:　　(1)体外部分:复肝丸浸膏作用于LX-2细胞的IC50为1656.7μg/mL。与对照组相比，不同浓度的复肝丸(62.5、125、250μg/mL)对LX-2细胞、原代 HSC均无明显毒性;与TGF-β1模型组相比，复肝丸低(L)、中(M)、高(H)剂量组可在不同程度上抑制HSC的增殖。在HL-7702细胞及原代肝细胞中，低、中、高剂量复肝丸对细胞活力有促进作用;与H2O2模型组相比，不同剂量复肝丸对肝细胞无明显保护作用。低、中、高剂量复肝丸可剂量依赖性地降低α-SMA表达、升高miR-101含量。低、中、高剂量复肝丸与miR-101mimic联合应用可不同程度抑制HSC增殖和F-actin的表达，且优于单独使用。复肝丸通过调控miR-101表达来下调PI3K、p-Akt、p-ERK1/2、mTOR、p70s6k的蛋白水平。　　(2)体内部分:与正常组相比，模型组小鼠肝体比明显增加，体重、脾体比无明显变化;肝肾功能指标ALT、AST、T.Bil、Cr、 BUN显著升高;Hyp含量明显增加;肝组织内炎细胞浸润明显，可见肝细胞的气球样变，汇管区结缔组织增生;肝组织胶原沉积显著;HSC活化指标α-SMA、纤维化指标ColⅠ表达明显增加。与模型组相比，复肝丸+miR-101激动剂组小鼠肝体比、脾体比、体重均有降低趋势;血清肝肾功能指标及Hyp含量显著降低;肝组织炎细胞浸润减少，胶原沉积有所改善，α-SMA、ColⅠ的表达亦降低。　　结论:　　1.miR-101在乙肝后肝硬化、肝癌组织中表达降低，且与血小板水平呈正相关，提示miR-101是慢性肝病的负调控因子;　　2.过表达miR-101抑制HSC活化、发挥抗肝纤维化的作用。　　3.复肝丸影响miR-101的表达发挥抗肝纤维化作用，其机制可能在于下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的转导。