第一部分 调控型胰岛素原真核表达载体的构建 目的:构建葡萄糖和胰岛素（INS）调节下的人胰岛素原真核表达载体,为在肝细胞内实现可调控的成熟胰岛素的表达奠定基础。方法 1 RT-PCR方法从胎儿胰腺获取野生型人胰岛素原cDNA。2 采用重叠延伸PCR法,在人胰岛素原cDNA上B链和C肽以及A链和C肽连接处制造两个点突变,该变异的胰岛素原cDNA片段命名为INS/furin,同时在INS/furin的两端分别加上HandⅢ、EcoRV两个酶切位点。3 扩增质粒p（G1RE）₃BP-1Luc,并分别用HandⅢ、EcoRV和KpnⅠ、Xhol酶切验证;4、将INS/furin亚克隆至含葡萄糖反应元件的质粒p（G1RE）₃BP-1Luc的多克隆位点上,构建质粒p（G1RE）₃BP-11×fur。结果:1、HindⅢ和EcoRV酶切质粒p（G1RE）₃BP-1Luc,切下一约1367Bp和一4700Bp的片段;Kpnl、Xhol双酶切后切下约368Bp和6200Bp的片段,与提供的该质粒资料符合;2、测序证实获得的野生型人胰岛素原cDNA与GeneBank序列一致;INS/furin的两个点变异存在;3、HindⅢ和EcoRV酶切质粒p（G1RE）3BP-11×furin,切下一约260Bp片段和一约4700Bp片段（见图3）,回收该280Bp片段,测序证实为INS/furin;结论:载体p（G1RE）3BP-11×furin构建成功,含葡萄糖反应元件的点突变胰岛素原基因真核表达载体p（G1RE）₃BP-11×furin有望成为糖尿病基因治疗理想的侯选载体之一。