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近年来,肿瘤治疗有了突破性进展,免疫疗法是目前肿瘤治疗的热点之一。嵌合抗原受体T细胞免疫治疗（Chimeric antigen receptor T cell immunotherapy,CAR T）是利用基因工程技术改造T细胞使其表达针对肿瘤抗原的受体进而靶向杀伤肿瘤的免疫新疗法。2017年CAR T治疗产品Kymriah（Tisagenlecleucel）上市首次用于治疗血液肿瘤,取得了较好的疗效。然而,在实体瘤治疗过程中由于肿瘤复杂的免疫抑制微环境等因素抑制了CART细胞的功能,使得该领域进展相对缓慢。肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤免疫抑制微环境中一类异常分化且占据大部分细胞比例的间质细胞。成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）,是 CAFs 的特异性标记物,其在部分肿瘤细胞和间质细胞都有表达。程序性死亡受体1（Programmed death-1,PD-1）是T细胞活化的负调控蛋白,PD-1单克隆抗体药物能提高T细胞抗肿瘤效应,在临床应用取得了良好的效果。本研究通过构建活性强且同时靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞的CART细胞,以期在实体瘤治疗中达到更好的治疗效果。CAR T细胞靶向性的关键成分目前主要以单链抗体（Single chain variable fragment,scFv）为主。传统单链抗体存在容易发生轻链和重链错配及需要优化连接铰链区等问题。纳米抗体（Nanobody,Nb）是近年来发现的一种天然的新型抗体,具有体积小,容易表达、可溶性好、稳定性强等优点,其在基础研究,新药开发、疾病诊断与治疗方面具有广阔的研究前景,成为各国竞相研究开发的对象。前期我们成功筛选了 FAP纳米抗体和PD-1纳米抗体,发现其具有抗肿瘤功能,在此创新的基础上我们进一步以FAP纳米抗体和PD-1纳米抗体为基础构建分泌PD-1纳米抗体靶向FAP抗肿瘤新型CAR T细胞（FAP-PD-1/Nb CAR T细胞）,探索其在实体瘤中的治疗效果。目的:构建分泌PD-1纳米抗体靶向FAP新型CAR T细胞（FAP-PD-1/Nb CART细胞）,探索FAP-PD-1/Nb CART细胞的体外活性及其对靶细胞的杀伤作用,体内FAP-PD-1/Nb CAR T细胞治疗对荷人HepG2-hFAP肝癌细胞异种移植瘤以及荷人U87胶质瘤细胞异种移植瘤的抑制作用,初步探讨FAP-PD-1/Nb CAR T细胞抗肿瘤作用及机制,为实体瘤CAR T细胞免疫治疗提供新思路和依据。方法:1.设计 CAR 基因序列,分别为 Mock、PD-1/Nb CAR、Irrelevant-PD-1/Nb CAR、FAP/Nb CAR、FAP-PD-1/Nb CAR 5 组;BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切方案切割GV400慢病毒载体,PCR鉴定目的基因片段的大小,进行目的基因与载体质粒的连接,将重组载体与包装质粒共同转染293T细胞包装慢病毒,收集并浓缩慢病毒颗粒,稀释计数法测算慢病毒滴度。2.分离培养正常人外周血T细胞,将获取的各组慢病毒感染原代T细胞完成各组CART细胞构建,流式细胞术检测各组CART感染效率,荧光显微镜观察GFP的表达情况,ELISA方法检测FAP-PD-1/Nb CART细胞分泌PD-1纳米抗体的情况,Western Blot检测FAP-PD-1/Nb CAR T细胞表达PD-1纳米抗体的情况。3.收集原发性肝癌患者手术组织,利用差异酶消化法联合反复贴壁法分离培养原代肝癌相关成纤维细胞（CAFs）,流式细胞术检测CAFs、U87、HepG2-hFAP、HepG2、A549 细胞中 FAP 的表达。4.以未感染的原代T细胞为对照（UTD）,流式细胞术检测UTD组,Mock组、PD-1/Nb CAR T组、Irrelevant-PD-1/Nb CAR T组、FAP/Nb CAR T组、FAP/Nb CAR T+PD-1 Nb 组、FAP-PD-1/Nb CAR T 组的 CAR T 细胞在FAP+靶细胞刺激后表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,耗竭分子LAG-3的表达以及各组CART细胞增殖情况。5.ELISA法检测各组CART细胞上清中分泌细胞因子（IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α）的含量。ELISPOT检测各组CAR T细胞经FAP+靶细胞刺激后分泌IFN-γ的细胞数量。流式细胞术检测CAR T细胞对靶细胞HepG2-hFAP、U87、HepG2、CAFs 的杀伤作用。6.构建NOD/SCID鼠异种移植瘤模型（HepG2-hFAP、U87）,经尾静脉注射同体积PBS,各组CART细胞和正常人T细胞,治疗两次,测量各组小鼠异种移植瘤体积大小,观察小鼠的生存期评估各组CAR T细胞在体内的抗肿瘤作用。7.治疗结束后取瘤制作石蜡切片,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中细胞增殖情况（Ki67）,检测肿瘤组织中的血管密度（CD31）,TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞的数目研究CART细胞的抗肿瘤机制。结果:1.应用双酶切方案成功完成GV400慢病毒载体切割并完成CAR基因与载体重组,将重组载体与包装质粒成功转染293T包装并浓度最终获得高滴度的慢病毒液。2.获得构建好的高滴度的重组CAR慢病毒可感染原代正常人T细胞,感染效率均在40%以上,ELISA法和Western Blot检测结果表明CAR T细胞构建成功且FAP-PD-1/Nb CART细胞可持续稳定地分泌PD-1 Nb。3.FAP 在 HepG2-hFAP 细胞的表达高于 CAFs、U87,FAP 在 HepG2、A549细胞中几乎不表达。4.FAP-PD-1/Nb CART细胞组在不同的FAP+靶细胞刺激后CD25、CD69、CD62L表达高于其他各组,耗竭分子LAG-3的表达低于FAP/Nb CAR组、FAP/Nb CAR+PD-1 Nb 组。FAP-PD-1/Nb CAR T 细胞组增殖活跃,增殖频率明显高于其他各组;FAP-PD-1/Nb CAR T细胞组分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α水平明显高于其他各组,IL-10表达水平各组无明显性变化。分泌IFN-γ的阳性细胞数目明显高于其他各组;FAP-PD-1/Nb CART细胞对FAP+靶细胞的杀伤效率高于其他各组。5.FAP-PD-1/Nb CAR T 细胞组能显著减缓 NOD/SCID 小鼠 HepG2-hFAP、U87皮下瘤的生长,延长小鼠的总体生存期。6.FAP-PD-1/Nb CART细胞治疗后显著促进了肿瘤细胞的凋亡,抑制了肿瘤细胞增殖,减少了肿瘤的微血管密度。结论:1.成功构建了以FAP纳米抗体和PD-1纳米抗体为基础的分泌PD-1纳米抗体靶向FAP新型CAR T细胞（FAP-PD-1/Nb CAR T细胞）。2.FAP-PD-1/Nb CAR T细胞在体外具备良好的功能活性且对靶细胞展现更强的特异性杀伤作用。3.FAP-PD-1/Nb CART细胞在体内具有良好的抗肿瘤的作用,这种以针对肿瘤微环境同时靶向肿瘤细胞设计分泌PD-1 Nb的新型CART细胞为CART治疗实体瘤提供了新的思路。