骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一类起源于间充质细胞的间叶组织恶性肿瘤,是一种最常见的恶性骨肿瘤,所占比例达原发性骨肿瘤的20%,年发病率约3%,好发于儿童和青少年。骨肉瘤本身恶性程度高、侵袭性强、易转移等生物学特性,在人体常表现出生长速度快、极其容易越过骨组织发生远处转移。临床上有多达20%的骨肉瘤患者在诊断时便发生了远处转移,其中肺部转移多见,约占90%。现有的治疗手段包括截肢手术、化疗等,对肺转移的患者作用极为有限,5年生存率仅20%至30%。尽管严重威胁青少年的健康,给无数家庭带来致命的负担,但更糟糕的是,自20世纪70年代迄今,骨肉瘤机制研究与临床治疗历经了长达50年的荒漠时期,依然无法解释骨肉瘤的生物学行为,导致当前的治疗对于改善骨肉瘤患者预后效果依然不尽人意。随着高通量测序技术的普及以及全球生物医药大数据指数增长,非编码RNA为恶性肿瘤研究提供了新思路。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一大类非编码RNA,细胞质或外泌体中多见,因缺少5’帽子和3’尾结构,被误认为是异常的副产物,功能潜力小。然而,随着检测手段和定量算法的进步,大量circRNA在多种肿瘤中潜在的生物学价值逐渐受到重视。这为在现有探索模式进度缓慢的情况下,充分探索骨肉瘤分子事件提供了新的可能性。基于上述考虑,本论文率先构建了骨肉瘤中circRNA的表达谱,以期全面了解这类新型小分子在骨肉瘤中的情况,同时,我们通过严格筛选、细胞、组织、大数据水平的多重验证,证实了我们候选circSATB2在骨肉瘤重要价值的稳健性,本论文工作中,我们首次从ceRNA假说机制、转录组水平的改变、组蛋白的表观调控等多个方面全面论证了circSATB2高表达可能促进骨肉瘤转移。不仅如此,基于老药新用和推广传统中医药为出发点,我们首次在治疗水平探索发现了来源于两面针的氯化两面针碱能够抑制circSATB2的表达从而减弱骨肉瘤迁移。具体说来,我们完成了以下几部分工作:第一部分工作中,我们首次构建了骨肉瘤组织的circRNA表达谱。我们circRNA芯片共发现骨肉瘤组织中多达500个显著差异表达的circRNA,这充分说明circRNA差异表达绝非偶然事件,它们非常有可能参与了骨肉瘤发生发展。因此,我们对表达谱进行了深入的分析,通过严格质控,源于宿主基因SATB2的3个circRNA（hsacirc0003915、hsacirc0007422和hsacirc0008928）显著高表达引起了我们的兴趣,通过筛选合适骨肉瘤细胞系,我们在进一步过表达和沉默的细胞实验中再次证实了其中之一hsacirc0008928的重要价值,通过大量可重复的实验,我们明确了hsacirc0008928在骨肉瘤组织中的显著高表达促进了骨肉瘤细胞迁移。第二部分工作中,我们进一步探索了hsacirc0008928促进骨肉瘤细胞迁移的分子机制。这部分工作全面探讨了hsacirc0008928基于经典的ceRNA假说发挥功能的可能性。FISH检测明确了circSATB2表达于细胞核和细胞质,这充分说明了circSATB2具备ceRNA调控的前提条件。大数据资源以及双荧光素酶报告实验一致推定了hsacirc0008928/miR-330-5p/SRF调控轴的存在。并且,在过表达hsacirc0008928后靶基因SRF的蛋白显著升高,为二者调控关系提供了进一步的证据支撑。我们最后通过细胞迁移功能回复实验证实了hsacirc0008928与miR-330-5p对迁移行为的共同作用。综上,本部分系统完整地验证了骨肉瘤中hsacirc0008928可能发挥重要生物学功能机制之一——ceRNA调控模式。第三部分我们全面观察了 hsacirc0008928在骨肉瘤中可能对转录组和基因组整体水平的影响,以期了解其发挥作用的主要方式。我们首先通过RNA-seq获取了 hsacirc0008928过表达后转录组中差异表达基因,同样发现了迁移调节相关通路的显著富集。并且GESA分析提示hsacirc0008928与组蛋白修饰H3K27ac存在密切关系,我们猜测hsacirc0008928可能通过更为复杂的表观调控参与调节骨肉瘤的迁移。基于上述考虑,我们检测了 hsacirc0008928过表达细胞系H3K27ac修饰的改变,ChIP-seq差异peak的相关基因同样显著富集于细胞迁移通路。而这进一步证实了 hsacirc0008928高表达促进骨肉瘤迁移,具体可能通过影响H3K27ac的修饰进而影响下游靶基因实现对迁移的影响。第四部分我们首次探索了 hsacirc0008928影响骨肉瘤迁移的其他潜在分子机制,旨在获取hsacirc0008928在骨肉瘤中发挥作用更为精准的信息。我们首次整合翻译要素ORF和IRES,发现hsacirc0008928可能具有翻译多肽的生物学潜能,并且通过hsacirc0008928翻译潜能的tag-多肽融合蛋白重组载体的构建、多肽产物的蛋白水平检测,探讨hsacirc0008928的编码能力。实验结果并未检测hsacirc0008928的翻译产物,说明hsacirc0008928可能不存在编码多肽调节机制,进一步为hsacirc0008928在骨肉瘤中的机制探索缩小了范围。第五部分工作中,我们充分结合骨肉瘤易转移的临床难点问题,探讨了干预手段对骨肉瘤的影响。该部分工作以老药新用以及对传统中医药挖掘推广为出发点,我们课题组前期在其他肿瘤治疗研究中发现来源于传统中药小分子氯化两面针碱可以下调hsacirc0008928的表达并且对肿瘤具有抑制作用,本课题实验惊喜地发现氯化两面针碱亦具有抑制骨肉瘤细胞迁移功能的作用,氯化两面针碱作用后转录组水平测序数据提示:氯化两面针碱很可能通过hsacirc0008928作用于细胞迁移相关通路上DRD1、CCL24、SEMA3C、BMP4、SYNE2这五个基因影响骨肉瘤迁移。通过本部分工作我们首次探讨了氯化两面针碱通过hsacirc0008928抑制骨肉瘤迁移的可能机制,为临床骨肉瘤治疗研究提供新思路,为中医药抗肿瘤提供更为丰富的分子理论依据。综上所述,本课题通过构建骨肉瘤circRNA表达谱,遴选出关键小分子hsacirc0008928,并从转录组水平、基因组水平、蛋白水平多层次探讨了 hsacirc0008928可能发挥作用的主要方式,通过大量分子实验,我们明确了 ceRNA作为关键调控机制的可能性。不仅如此,基于临床难点问题,我们首次探讨了氯化两面针碱可能抑制骨肉瘤迁移的分子机制,为推广传统中医药提供了丰富的理论依据。