研究背景慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease, CKD)最终的病理结局均表现为肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis),其组织病理学特征包括大量的细胞外基质和炎性细胞在间质沉积、肾小管细胞丢失、肌成纤维细胞聚集、小管周围微脉管系统变薄等。纤维化的过程不可逆,当正常肾组织被纤维化组织替代,肾功能严重受损。无论病因如何,发展到肾间质纤维化阶段,病人的肾功能将进行性下降,并最终需要透析或肾移植。因此充分理解肾间质纤维化发生的原因和机制,找到控制纤维化的治疗方法,对于改善慢性肾脏疾病患者的生存期和生存质量具有重要意义。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的全身多器官受累的自身免疫病,其最常见的器官受累为肾脏,即狼疮性肾炎。狼疮性肾炎的结局也涉及肾间质纤维化和肾功能衰竭。研究肾间质纤维化发生发展的机制有助于寻找阻断狼疮性肾炎发展进程的策略和方法。IL-17是新近受到广泛关注的重要炎性细胞因子,它在肾间质纤维化中的意义是我们关注的问题。既往有一些研究者发现产生IL-17的细胞存在于纤维化的肾移植组织中,但IL-17在肾脏纤维化中的确切价值尚不清楚。复习IL-17与其他脏器纤维化关系的文献,发现关于IL-17在组织纤维化中的重要性尚未得出明确结论。有关心肌纤维化的多篇研究认为IL-17是促进心肌纤维化的一个重要因素；在博来霉素和IL-1p诱导的特发性肺纤维化模型中,IL-17基因敲除鼠发生肺纤维化的症状减轻,然而IL-13诱导的特发性肺纤维化在IL-17基因敲除鼠并未观察到与野生型之间的显著差异；在矽肺的疾病模型中,IL-17受体基因缺陷鼠的急性炎症有所减轻,但慢性炎症和肺纤维化程度并未明显改善,研究者认为IL-17并不介导矽肺性肺纤维化。新近还有关于肝纤维化的研究显示,IL-17既可以通过诱导一些炎性细胞因子的表达、诱导促纤维化因子TGF-β的表达,而促进肝纤维化发展,又可直接上调胶原的合成、促进肌成纤维细胞的活化。综上,由于组织器官的不同和疾病模型的差异,IL-17在器官纤维化发生发展中的作用的研究得到并不完全一致的结论。而IL-17在肾间质纤维化中的作用尚不明确,探讨IL-17在肾间质纤维化中的意义是一个值得研究的课题。研究目的观察并比较IL-17基因敲除鼠(IL-17-/-)发生单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)诱导的肾间质纤维化的疾病特征；分析IL-17对TGF-β所诱导的肌成纤维细胞的活化及其纤维化相关蛋白表达的影响；从胞内信号的角度观察IL-17调节TGF-β所诱导的肾间质纤维化的分子机制。研究方法1.总体设计本研究通过体内、体外实验来观察IL-17对肾间质纤维化发展的作用：在体内实验部分,采用IL-17-/-与野生型小鼠,对比单侧输尿管梗阻(UUO)手术后肾间质纤维化的病情严重程度有无差异；在体外实验部分,观察IL-17对TGF-β诱导的肾脏肌成纤维细胞表达α-SMA、合成Ⅰ型胶原(type I collagen)和纤连蛋白(fibronectin, FN)的调节作用,探讨IL-17在肾间质纤维化发生发展中的意义。同时寻找并确定TGF-β的经典和非经典的促纤维化胞内信号分子在IL-17调节肌成纤维细胞的活化与功能中的激活状况。2.体内实验2.1UUO模型制作及分组将IL-17-/-小鼠与野生型(WT)C57BL/6小鼠的左侧输尿管结扎作为实验组,小鼠开腹缝合不结扎作为假手术组(Sham)。分别于手术后第3、7天处死,取手术侧肾组织。2.2UUO小鼠肾组织IL-17mRNA表达自实验组与假手术组小鼠肾脏提取RNA,用荧光定量PCR法检测肾组织中IL-17mRNA表达水平。2.3纤维化相关指标检测2.3.1组织病理染色取实验组与假手术组小鼠梗阻侧肾组织制作石蜡切片,以HE染色观察肾组织结构,以PAS染色评价肾小管损伤及间质纤维化程度,以Masson染色显示胶原沉积情况。2.3.2纤维化相关因子的表达自实验组与假手术组小鼠肾脏提取RNA,用荧光定量PCR法检测肾组织中肌成纤维细胞标志α-SMA及纤连蛋白(fibronectin, FN), I型胶原的mRNA表达水平。同时用免疫组化分析α-SMA,I型胶原和FN蛋白在肾组织的表达水平。3.体外实验将野生型C57BL/6小鼠处死,取肾组织,分离培养成纤维细胞；以TGF-β1诱导其分化为肌成纤维细胞；然后分组：IL-17处理作为实验组,无IL-17A处理的作为对照组。用荧光定量PCR检测两组α-SMA> FN、I型胶原mRNA表达水平,western blotting检测α-SMA蛋白水平。同时培养肾脏来源的成纤维细胞NRK-49F和非肾脏来源的BALB/3T3成纤维细胞,对比二者在接受IL-17处理之后,对TGF-β诱导的肌成纤维细胞表达α-SMA、合成纤连蛋白和Ⅰ型胶原的作用之间的差异。在上述细胞培养体系中进一步分析IL-17调节TGF-β诱导肌成纤维细胞活化与功能的胞内信号机制,包括经典的Smad途径和不依赖Smad的非经典信号途径。研究结果1.体内实验1.1UUO小鼠肾组织IL-17mRNA的表达UUO模型组WT小鼠随着梗阻时间延长,肾组织IL-17mRNA表达增多：IL-17-/-小鼠由于IL-17基因敲除,无IL-17mRNA表达；假手术组也无IL-17mRNA表达。1.2组织病理染色1.2.1HE染色后在高倍镜(×400)下观察,可见随着梗阻时间延长,实验组小鼠的肾间质中有大量炎性细胞浸润,其中IL-17-/-小鼠的肾间质炎症比野生型更严重。假手术组未见明显的炎性浸润。1.2.2PAS染色结果显示UUO实验组小鼠肾小管萎缩,基底膜皱缩呈锯齿状,间质面积增大。这些病理改变在IL-17-/-小鼠更为显著。1.2.3Masson染色结果可见UUO造模组小鼠肾间质胶原沉积明显,IL-17-/-小鼠UUO术后第7天的胶原沉积面积显著大于WT组。1.3纤维化相关因子表达UUO模型组IL-17-/-小鼠梗阻术后第3、7天的α-SMA、FN、I型胶原mRNA表达水平均高于野生型小鼠,免疫组化染色也显示在IL-17-/-小鼠其UUO术后第7天的肾脏表达较高的α-SMA、FN和I型胶原。2.体外实验TGF-β可诱导小鼠肾脏原代成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,表达α-SMA。当加入IL-17处理,肌成纤维细胞表达α-SMA、合成FN和Ⅰ型胶原均低于未处理组。肾脏来源的NRK-49F成纤维细胞经TGF-β诱导,高表达α-SMA并大量合成FN和Ⅰ型胶原,IL-17可以抑制NRK-49F表达α-SMA、并抑制其合成FN和Ⅰ型胶原,在培养的不同时间点均可见这一规律。而非肾脏来源的成纤维细胞株BALB/3T3,经TGF-β诱导为肌成纤维细胞,表达α-SMA、合成FN和Ⅰ型胶原,却不能被IL-17稳定地抑制。3.胞内信号机制IL-17-/-鼠经UUO手术后发生严重的肾间质纤维化时其肾脏TGF-β水平并未显著增高。当IL-17与TGF-β同时处理肾脏成纤维细胞NRK49F,其Smad2/Smad3的量以及磷酸化的Smad2/Smad3的表达与单独TGF-β处理时无明显差异。而在非经典途径相关的信号分子中,已经看到磷酸化的Akt和P70S6K以及非磷酸化的TSC2(活性状态)均受到IL-17调节。目前的关于分子机制的研究结果提示我们,在IL-17抑制成纤维细胞增殖、合成细胞外基质的调节作用中,至少有PI3K-Akt-TSC2-P70S6K信号途径的参与。IL-17通过抑制P70S6K及Akt的磷酸化、保持TSC2的非磷酸化状态,从而抑制成纤维细胞的活化与功能。研究结论本文在UUO模型中发现IL-17-/-鼠发生肾间质纤维化的严重程度显著重于野生型鼠。体外实验进一步明确显示IL-17可以抑制TGF-β诱导的肾脏肌成纤维细胞表达a-SMA、合成FN和Ⅰ型胶原,而对非肾脏来源的肌成纤维细胞没有这种抑制作用。IL-17对TGF-β所诱导的肾脏肌成纤维细胞的抑制效应至少可以通过调节TGF-β的非经典信号途径PI3K-Akt-TSC2-P70S6K的相关信号分子的磷酸化来实现。本研究通过体内和体外实验、从多层次多指标、多角度地显示IL-17在肾脏纤维化中的调节作用,为理解纷繁复杂的IL-17与组织纤维化之间的关系提供了重要的实验证据。