流行性感冒是由流感病毒（Influenza virus,Ⅳ）引起的一种人兽共患的呼吸道传染病（Respiratory infectious diseases,RID）。1997 年 H5N1 禽流感（Avian influenza,AI）出现跨种传播并致人死亡,2013年H7N9禽流感在国内活禽市场爆发,造成直接经济损失高达65亿元,并且同年陆续有人类感染病例出现。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）称流感每年导致29-65万人死亡。H1N1毒株曾在1918年引起流感大流行,造成全球范围内逾5000万的死亡病例。流感流行给公共卫生系统以及畜禽养殖业带来了沉重打击。疫苗接种是预防流感的有效措施,然而当前的季节性流感疫苗不能提供有效的免疫保护效果,依旧迫切需要高效的疫苗来应对流感流行。近年来,M13噬菌体因其基因的可编辑性及表面的可修饰性,被广泛用于疫苗载体研究。此外,有研究证实锰离子（Manganese ions,Mn2+）可以通过激活cGAS/STING信号通路促进树突状细胞（Dendriticcells,DC）活化,有望成为一种新型的免疫佐剂。本研究在实验室前期构建的基因工程化M13噬菌体基础上,进一步利用二氧化锰纳米粒（MnO2 NPs）对其进行表面修饰,从而获得了可以在真核细胞中表达HA颈部抗原的锰化M13噬菌体流感疫苗。进一步评价其细胞内过程、体内外免疫激活效应及攻毒保护作用,验证锰化M13噬菌体作为流感疫苗载体的可行性。具体内容概述如下:（1）合成羧基化MnO2纳米粒,进一步通过酰胺化反应将其连接到携带HA颈部序列的M13噬菌体（M13-HA）上,获得锰化修饰的噬菌体载体疫苗（MnO2-M13-HA）。结果显示,MnO2纳米粒在进行羧基化修饰之后,透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）以及扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）显示其表面刺突呈现模糊状态。元素mapping结果显示纳米粒表面引入了大量硫元素,表明2,3-二巯基丁二酸（DMSA）修饰的纳米粒制备成功。纳米粒粒径较修饰前增大至220 nm,电位则下降至-35±5.1 mV,即获得了 MnO2-COOH纳米粒。最终,在透射电镜下观察到了 M13-HA同MnO2-COOH纳米粒成功结合的图像,表明MnO2-M13-HA构建成功。（2）为研究MnO2-M13-HA的胞内分布及其对DC的激活作用,利用激光共聚焦显微镜对MnO2-M13-HA的细胞摄取效率及其溶酶体逃逸能力进行评估,之后采用流式细胞术及qPCR分别对DC2.4成熟相关表面标志物及其炎性细胞因子水平进行测定。结果显示,MnO2-M13-HA在同DC2.4孵育4h时即表现出充分的细胞摄取效果。由于Mn2+在溶酶体内的积累,部分MnO2-M13-HA在4h时得以通过“质子海绵”效应实现溶酶体逃逸。孵育时间延长至6 h时,MnO2-M13-HA的溶酶体逃逸效果进一步提升,这对于防止基因疫苗被提前降解至关重要。此外,MnO2-M13-HA释放的Mn2+可以通过激活cGAS/STING信号通路来促进DC2.4活化,显著提升DC成熟相关表面标志物CD80、CD86、CD40、MHC-I的表达以及炎性细胞因子产生,表现出强效的DC活化能力。（3）为研究MnO2-M13-HA的体内水平免疫应答诱导效果,我们首先测定了MnO2-M13-HA的体内代谢动力学及其体内分布。研究发现MnO2-M13-HA于注射后6h在脾脏及淋巴结大量蓄积,有利于其对免疫反应的诱导。研究显示,MnO2-M13-HA能够有效促进淋巴结DC活化。我们进一步探究了其对适应性免疫反应的影响。于第二次免疫后14天收集小鼠脾脏进行脾脏淋巴细胞增殖分化的流式分析,并收集小鼠血清进行抗体水平检测。结果显示,MnO2-M13-HA能够诱导高效的CD4+T细胞免疫反应、CD8+T细胞免疫反应以及体液免疫反应,我们推测这是由于MnO2-M13-HA高效的DC活化能力所致。（4）为研究MnO2-M13-HA的攻毒保护效力,在第二次免疫后14天对小鼠进行流感病毒PR8攻毒。攻毒后第六天收集小鼠肺脏进行肺指数评价、肺部病毒载量测定及病理切片观察,并于攻毒后对小鼠展开为期两周的体重及存活率指标监测。结果发现,MnO2-M13-HA免疫组的小鼠能够有效抵抗流感病毒感染,体现了100%的疫苗保护效力。据病理切片观察,该组小鼠肺泡结构正常,无明显的红细胞渗出及炎性细胞浸润,显著改善了流感病毒对小鼠肺脏的侵袭。因此,MnO2-M13-HA是极具潜力的新型流感疫苗,其诱导的免疫保护能够成功抵抗流感病毒的感染。