论文部分内容阅读
研究目的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指非酒精和其他明确因素所致的代谢综合征,弥漫性肝细胞中大泡性的脂肪病变是NAFLD的主要病理特征,有单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)和肝硬化三个阶段。非酒精性脂肪肝的发病机制目前尚不清楚,比较被认可的发病机制是“二次打击”学说。瑞香素(Daphnetin,DAP)是从瑞香属(DaphneLinn)植物长白瑞香中提取出来的有效成分,具有良好的抗氧化、抗炎活性。目前尚未见瑞香素对非酒精脂肪肝影响的文献报道。本文以油酸处理的HepG2细胞作为非酒精性脂肪肝炎体外研究模型,从脂代谢、胰岛素敏感性和氧化应激三方面,研究了瑞香素对NASH的预防和治疗作用及其机制。实验方法HepG2细胞经0.5 mM油酸(oleic acid,OA)处理24h作为体外研究NASH的细胞模型,DAP给药方式分为预防模式与治疗模式两类。在预防模式时,HepG2细胞用OA和DAP(5、20、50μM)同时处理24h;在治疗模式时,HepG2细胞先用OA处理24h,再用DAP(5、20、50μM)处理模型细胞24h。给药后用试剂盒检测细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)含量和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量及细胞对葡萄糖的摄取能力,用实时荧光定量(RT-qPCR)法和蛋白印记(Western Blot)法检测细胞中糖脂代谢关键基因(环腺苷酸依赖的蛋白激酶AMPK,固醇调节元件结合蛋白SREBP-1C,马铃薯糖蛋白样磷酯酶结构域蛋白PNPLA3,过氧化物酶体增殖物激活受体PPARα,磷脂酰肌醇激酶PI3K,蛋白激酶AKT)和氧化应激相关基因(细胞色素P450 CYP 4A)的mRNA与蛋白表达量。实验结果预防模式下:(1)与空白对照组相比,OA处理模型组胞内TG含量,SREBP-1C和PNPLA3 mRNA及蛋白的表达量明显上调,PPARαmRNA及蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显下调;与OA处理组相比,OA+DAP组胞内TG含量,SREBP-1C、PNPLA3 mRNA与蛋白表达量明显下调,PPARαmRNA与蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显上调。(2)与对照组比较,OA处理组细胞对荧光葡萄糖的吸收明显降低,PI3K蛋白表达及pAKT/AKT下调;OA+DAP处理后,细胞的糖摄取能力提高,PI3K蛋白表达及pAKT/AKT上调。(3)与对照组比较,OA处理组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显增多;与OA处理组比较,OA+DAP组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显下调。治疗模式下:(1)与对照组相比,OA处理组胞内TG含量,SREBP-1C和PNPLA3 mRNA及蛋白的表达量明显上调,PPARαmRNA及蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显下调;与OA处理组相比,OA和瑞香素联合处理组胞内TG含量,SREBP-1C、PNPLA3 mRNA与蛋白表达量明显下调,PPARαmRNA与蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显上调。(2)与对照组比较,OA处理组细胞对荧光葡萄糖的吸收明显降低,PI3K蛋白表达及pAKT/AKT下调,OA和瑞香素联合处理后,细胞的糖摄取能力提高,PI3K蛋白表达及pAKT/AKT上调。(3)与对照组比较,OA处理组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显增多;与OA处理组比较,OA和瑞香素联合处理组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显下调。预防和治疗两种不同的给药方式下,DAP都能明显缓解模型细胞脂堆积,胰岛素抵抗与氧化应激损伤情况,两者效用差不多。实验结论瑞香素能明显缓解OA诱导的HepG2细胞脂堆积,胰岛素抵抗与氧化应激损伤,具有一定的预防和治疗作用,其作用机制包括:(1)可能通过上调糖脂代谢关键因子AMPK的磷酸化水平,抑制脂合成关键基因SREBP-1C、PNPLA3的表达,同时诱导脂氧化关键基因PPARα的表达,进而降低了肝细胞的脂堆积。(2)可能通过上调PI3K的表达及pAKT/AKT水平,缓解胰岛素抵抗,从而促进肝细胞对葡萄糖的摄取。(3)可能通过抑制活性氧生成关键基因CYP4A的表达,缓解肝细胞的氧化损伤。