背景和目的近年来,具有自我更新和多分化能力的间充质干细胞,在组织再生工程方面受到了广泛关注。而在口腔医学领域,一些间充质干细胞潜在性来源已经被证实为口腔组织工程的候选,如骨髓间充质干细胞、脂肪组织、脐带血和口腔组织等。2000年,Gronthos等人首先成功地从人牙髓组织中分离培养出第一种牙源性干细胞,并命名为牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs),为牙间充质干细胞的研究开创了一个新纪元[2]。随后,学者们分离出了其它牙间充质干细胞,包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、人乳牙牙髓干细胞(human deciduous teeth stem cells,SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)、上皮根鞘细胞(epithelial root sheath cells)和牙囊干细胞(dental sac stem cells,DFPCs)等。口腔组织间充质干细胞具有多分化潜能,在特定的培养条件下能向成骨、成牙、成脂、神经性、软骨细胞以及肌原性等方向分化。而在口腔组织再生应用方面,成骨分化潜能是最明显的特征之一。有研究表明DPSCs在体外能分化成骨样组织,并在植入免疫缺陷小鼠皮下能在体内形成异位的牙髓牙本质样复合组织,是口腔组织再生工程的候选干细胞来源。近年来,一些病例报告显示：患有根尖周炎或根尖脓肿的年轻恒牙,在经过保守的根管治疗后牙根尖持续发育成形。传统知识难于解释此病理现象。而最近发现的存在于年轻恒牙根尖乳头中的新间质干细胞群,在一定程度上能佐证上述病理现象。这些细胞被称为根尖乳头干细胞(Stem cells from apical papilla, SCAP)。在牙根开始发生时,颈环处内釉和外釉上皮细胞向根尖方向增殖,牙乳头间质细胞分化成成牙本质细胞,后者形成原发性牙本质,将牙乳头包围起来并使其发育成为牙髓。在根尖乳头和牙髓间有一个富含细胞的区域,而干细胞分别位于牙髓和根尖乳头组织中,且各自特性也不同112-15]。三氧化矿物聚合物(Mineral trioxide aggregate, MTA)是一种已被美国食品药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)认可的新型生物材料,现已广泛应用于年轻恒牙血管再生术、直接盖髓术、根尖诱导成形术和活髓切断术等。MTA毒性低,具有抗菌性和良好的生物组织相容性,与细胞和/或组织接触后能够促进组织的再生。而近年来研究发现,在以MTA为诱导剂的牙髓血管再生治疗中,可观察到根管壁明显增厚、根尖延长成形,更有意义的是部分病例牙齿活力测试有反应,这在一定程度上表明了MTA可能在根尖继续发育中起着一定的作用。然而,目前MTA促进组织再生的机制尚未完全清楚,有待进一步的研究以证实。目前SCAP生物学特性的研究正处于初始阶段。因此,本实验的第一章的研究目的是比较年轻恒牙的DPSCs和SCAP两者的干细胞表型特点、细胞活性、矿化潜能、组织再生能力、多向分化潜能等体外生物学特性。同时在上述实验基础上,进一步比较研究MTA对SCAP与DPSCs增殖、分化的影响,为临床治疗根尖病变的年轻恒牙提供新思路及理论指导,进而为牙齿的继续发育以及牙齿再生的研究提供一定的理论依据。第一章人根尖乳头干细胞和牙髓干细胞的体外培养和鉴定方法：完整拔除人牙根尚未发育完成的正畸牙或第三磨牙,分离根尖乳头和牙髓组织,并用组织贴块法进行原代培养SCAP和DPSCs。倒置显微镜下观察SCAP和DPSCs原代细胞和传代细胞的生长情况及形态特征。将两者的第2代细胞接种于盖玻片上,利用免疫荧光技术检测干细胞标志物STRO-1的表达情况。将对数生长期的SCAP和DPSCs制成细胞悬液,并接种至6孔板中,培养7d后,加入结晶紫染液染色,观察细胞克隆形成情况。采用MTT法分别连续10d测定SCAP和DPSCs第3代细胞的OD值,绘制两种干细胞的生长曲线。取两者的第2代细胞在成脂诱导液条件下进行培养,观察到脂滴形成后行油红-O染色。对经矿化诱导4w后的SCAP和DPSCs行茜素红染色,并行茜素红半定量测定两组干细胞的的钙含量以比较SCAP和DPSCs矿化结节形成能力的大小。对矿化诱导4w后的SCAP和DPSCs采用免疫荧光技术检测成骨标志碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase, ALP)、骨涎磷蛋白(bone sialophosphoprotein, BSP)、骨钙素(osteocalcin, OC)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)的表达情况。应用荧光定量PCR仪7900分别检测SCAP和DPSCs矿化诱导7d、14d、21d的ALP、DSP、BSP、OC基因的mRNA表达水平,定量比较两类干细胞体外成骨/成牙骨质能力大小。结果：根尖牙乳头和牙髓组织块在培养瓶内培养7d后,镜下可见有贴壁细胞以组织块为中心成放射状生长。两组的大部分细胞为成纤维细胞样生长,呈梭形,轮廓清晰,大小基本一致。对原代培养的SCAP和DPSCs爬片行抗STRO-1免疫荧光检测,镜下可见两种干细胞的细胞核呈蓝色荧光,胞浆呈绿色荧光,为阳性表达。两组干细胞培养7d后行结晶紫染液染色,镜下可见有明显的细胞集落形成,其中SCAP的克隆形成率为8.5%,而DPSCs的克隆形成率为5%。经统计学分析,SCAP的克隆形成率高于DPSCs,差异具有统计学意义(P<0.05)。SCAP和DPSCs的生长曲线近似呈“S”型,1-2d为潜伏期,3-8d为对数生长期,细胞生长速度加快,8d后进入平台期,细胞生长速度减慢,符合干细胞慢周期的特点。第4d开始SCAP组与DPSCs组比较,差异存在统计学意义(P<0.05)。两组干细胞体外诱导成脂3w后行油红-O染色均呈阳性,镜下可观察到有明显的红色脂滴形成。矿化诱导至4w后,两组干细胞运用茜素红染色法检测,镜下可见有橘红色矿化结节形成。茜素红半定量测定两组干细胞的的钙含量,其中SCAP的钙含量为5.89±0.41,明显高于DPSCs的3.83±0.27,差异具有统计学意义(P<0.05)。对矿化诱导4w后的两组干细胞爬片行抗ALP、DSP、BSP、OC的免疫荧光检测,结果显示均为阳性,其中SCAP组的荧光强度高于DPSCs的荧光强度。而荧光定量PCR结果显示随着诱导时间增加,BSP、 DSP及OC基因水平表达上调,ALP基因水平则是随着诱导时间增加而下降,且SCAP组中各基因的mRNA表达水平均高于DPSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：本实验成功地对人根尖乳头干细胞和牙髓干细胞进行原代培养,并在体外对两组干细胞行成骨性/牙源性的分化及相关成骨标志物的鉴定,证实了根尖乳头干细胞具有干细胞的表型特点及多向分化潜能,细胞活性及矿化潜能均高于牙髓干细胞,是一种更优秀的干细胞来源。第二章MTA对人根尖乳头干细胞和牙髓干细胞增殖、分化影响的比较研究方法：参照Hakki等的方法制备浓度为20mg/ml的MTA浸提液。取对数生长期的SCAP和DPSCs第3代细胞,将培养基更换成含0.2mg/ml MTA的培养基,并设对照组,每组做3复孔,重复3次,分别于培养1d、3d、5d、7d后,测定OD值。分别取第3代的SCAP和DPSCs两种干细胞,饥饿12h后,实验组加入含0.2mg/ml MTA的培养基,对照组为不含MTA培养基。分别收集作用12h、24h、36h和48h后的细胞,应用荧光定量PCR仪7900检测两种干细胞ALP、DSP、BSP、OC基因的mRNA表达的变化。结果：0.2mg/ml MTA作用于两种干细胞后,与对照组相比,两组细胞增殖活性均随时间延长而增高,各实验组与对照组差异存在统计学意义(P<0.05),表明0.2mg/ml的MTA能够有效地促进SCAP和DPSCs增殖的生物活性。在MTA作用5d、7d后,与DPSCs相比,SCAP的增殖速度增高明显高于DPSCs,差异具有统计学意义(P<0.05)。0.2mg/ml MTA作用两种干细胞不同时间后,OC和DSP mRNA的表达水平呈时间依赖性,而ALP和BSP mRNA的表达水平则是先上升后下降。同时,与DPSCs相比,SCAP各基因的mRNA的相对表达量明显高于DPSCs,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：本实验通过0.2mg/ml MTA浸取液来控制MTA释放钙离子的浓度,比较观察MTA对SCAP和DPSCs的增殖、分化的影响,一定程度上证明了适宜浓度的MTA能够有效地促进DPSCs和SCAP的增殖和分化,为牙髓血管再生技术应用于年轻恒牙根尖周组织病变的临床治疗提供了一定的理论依据。总之,通过组织块贴壁法成功分离的到人年轻恒牙的根尖乳头干细胞和牙髓干细胞,并分析了两种干细胞的生物学性状,说明了根尖乳头干细胞和牙髓干细胞两组干细胞为间充质来源的干细胞,同时也证实了根尖乳头干细是一种更优秀的干细胞来源。而在适宜浓度的MTA作用下,与DPSCs相比,SCAP在增殖率、矿化潜能和牙本质细胞外基质表达等方面能力更强,可能是至今为止最优秀的早期牙源性干细胞来源,在临床应用于牙髓再生中更具有广阔的应用前景。