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多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)作为溴代阻燃剂广泛应用于各种消费类产品,已成为全球范围内的持久性环境污染物。PBDEs释放到环境介质中持久存在并且难降解,造成环境污染并通过食物链进入人体,危害人体健康,日益引起国际社会的关注。PBDEs不仅能影响生物体的生长、神经发育和生殖,还可以在细胞和分子水平导致氧化应激、促使自由基的产生,影响相关基因的表达,甚至引起细胞死亡。本研究通过体外细胞实验对比研究BDE-47(tetrabrominated d iphenylether-47, BDE-47)和BDE-209(decabrominated diphenyl ether-209, BDE-209)对小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a)的神经毒性作用及其产生机制。拟采用外源性干扰细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和钙离子(Ca。+)水平,阐明细胞内ROS和Ca2+水平变化与PBDEs诱导神经细胞凋亡的关系。检测p38MAPK和核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通路相关蛋白和基因的表达,阐明BDE-47和BDE-209诱导的Neuro-2a细胞凋亡过程中ROS和Ca2+介导的信号通路。对BDE-47和BDE-209的毒性和机制的研究,为PBDEs所致神经毒性的分子机制研究提供理论基础,也为预防控制PBDEs对机体健康的危害提供基础资料和理论依据。研究结果如下：1、BDE-47和BDE-209对Neuro-2a细胞的毒性效应(1) MIT和台盼蓝实验结果表明BDE-47和BDE-209具有明显的细胞毒性作用,均能显著降低Neuro-2a细胞的活力,抑制细胞生长,增加细胞死亡率。LDH释放实验显示BDE-47和BDE-209能造成细胞膜损伤,促使细胞内乳酸脱氢酶的释放。并且BDE-47比BDE-209呈现出更高的损伤能力和抑制效果。流式细胞术检测数据显示BDE-47对Neuro-2a细胞具有显著的周期阻滞作用,将细胞阻滞于G1期。光学倒置显微镜,Hoechst33342染色观察Neuro-2a细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染的流式检测结果表明BDE-47和BDE-209能够不同程度的诱导Neuro-2a细胞凋亡,且BDE-47比BDE-209诱导细胞凋亡的程度大。以上结果表明BDE-47和BDE-209均能产生明显的细胞毒性作用,且BDE-47对Neuro-2a细胞表现出更大的细胞毒性。(2) BDE-47能够干扰Neuro-2a细胞正常周期进程,将细胞阻滞于G1期；Western Blot和qRT-PCR检测结果显示BDE-47可以增加Neuro-2a细胞内p53和p21mRNA的表达水平,通过抑制周期相关蛋白(cyclin D1和CDK2)的表达,降低磷酸化Rb蛋白水平,从而调控Neuro-2a细胞G1/S时相的转换,将细胞停滞于G1期而不能进入S期,最后导致细胞生长受到抑制。BDE-209对Neuro-2a细胞周期则没有明显的影响。2、BDE-47和BDE-209通过死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路3条凋亡通路诱导Neuro-2a细胞凋亡(1) qRT-PCR和Caspase活性检测结果显示BDE-47和BDE-209增加受体蛋白Fas mRNA和Fas相关死亡结构域蛋白FADD mRNA的表达水平,同时增加Caspase-8蛋白活性,最后增加Caspase-3蛋白活性,通过死亡受体通路诱导Neuro-2a细胞凋亡；(2) qRT-PCR检测结果显示BDE-47和BDE-209能增加促凋亡蛋白Bax的mRNA表达水平,增高Bax/Bcl-2比值；流式细胞术,Western Blot和Caspase活性检测结果显示BDE-47和BDE-209降低Neuro-2a细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),增加胞质中细胞色素C (cytochrome C, CytC)蛋白表达水平,增加Caspase-9的活性,最后激活Caspase-3,能通过线粒体通路诱导Neuro-2a细胞凋亡：(3) qRT-PCR和Caspase活性检测结果显示BDE-47和BDE-209能增加GRP78和CHOP mRNA的表达,并且增加Caspase-12活性通过内质网通路诱导Neuro-2a细胞凋亡。3、细胞内ROS和Ca2+介导的信号通路参与BDE-47和BDE-209诱导Neuro-2a细胞凋亡的过程(1) 应用特异性荧光染料二乙酸-2’,7’-二氯荧光素盐(2’,7,-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)检测BDE-47和BDE-209胁迫的Neuro-2a细胞内总ROS水平的变化,结果表明BDE-47和BDE-209呈剂量依赖性的增加细胞内总ROS水平。流式细胞术结果显示抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)能够抑制BDE-47和BDE-209所致的细胞内总ROS水平的升高,缓解BDE-47和BDE-209所致细胞凋亡的程度和细胞MMP下降的程度,BDE-47和BDE-209可能通过活性氧介导线粒体通路诱导Neuro-2a细胞凋亡。(2)BDE-47和BDE-209胁迫后,促使细胞内总ROS水平升高,破坏Neuro-2a细胞内氧化还原状态的平衡。对丙二醛(malonaldehyde, MDA)检测结果显示BDE-47增加细胞内脂质过氧化产物MDA含量,造成细胞内脂质过氧化损伤。BDE-209没有明显的变化。对谷胱甘肽(glutathiose, GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)检测结果发现BDE-47和BDE-209能不同程度的升高GSSG/GSH的比率,使Neuro-2a细胞处于氧化应激的状态。同时,启动Neuro-2a细胞内抗氧化系统,qRT-PCR检测结果显示Nrf2基因表达上调,抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)下游的抗氧化酶和解毒酶(HO-1、NQO1、GPX、GCLM和GCLC)表达水平都有不同程度的增加,GR基因表达水平下降,抗氧化／解毒酶响应细胞内产生的氧化应激,提示Nrf2-ARE通路参与了BDE-47和BDE-209内源性应激防御机制。(3) 应用荧光染料Fluo-3AM检测BDE-47和BDE-209胁迫Neuro-2a细胞内Ca2+水平的变化,BDE-47和BDE-209均能在前10 min内呈剂量依赖性的增加细胞内Ca2+水平。流式细胞术结果显示Ca2+螯合剂(BAPTA)能抑制BDE-47和BDE-209所致的细胞内Ca2+水平的升高,缓解BDE-47和BDE-209所致细胞凋亡的程度,细胞内C8.2+水平的升高是BDE-47和BDE-209诱导Neuro-2a细胞凋亡的另一原因。光溜海绵素(Xestospongin C, Xe C)和丹曲林(Dantrolene,Dan)是细胞内内质网钙库的抑制剂,Xe C和Dan均能抑制BDE-47和BDE-209所致的Neuro-2a细胞内升高的Ca2+水平,也能缓解BDE-47和BDE-209所致细胞凋亡的程度,Neuro-2a细胞凋亡过程中内质网应激,使得Ca2+外流,导致BDE-47和BDE-209诱导Neuro-2a细胞凋亡过程中Ca2+水平升高。(4) AlphaScreen技术检测细胞内p38 MAPK磷酸化水平结果显示：BDE-47和BDE-209均能增加Neuro-2a细胞内磷酸化p38 MAPK蛋白的表达水平,流式细胞术结果显示p38 MAPK抑制剂SB203580可以显著性的抑制BDE-47和BDE-209导致Neuro-2a细胞凋亡,提示p38 MAPK通路参与了BDE-47和BDE-209诱导Neuro-2a细胞的凋亡。同时,使用抗氧化剂NAC和细胞内Ca2+螯合剂BAPTA能降低BDE-47和BDE-209所致的Neuro-2a细胞内磷酸化p3gMAPK蛋白水平,提示BDE-47和BDE-209能通过细胞内的ROS和Ca2+通过介导p38 MAPK通路诱导Neuro-2a细胞凋亡。综上所述,BDE-47和BDE-209对Neuro-2a细胞具有细胞毒性,产生机制可能与ROS导致氧化应激和细胞内Ca2+的增多有关,可影响细胞内p53信号通路、p38 MAPK通路和Nrf2-ARE信号通路多种代谢通路诱导Neuro-2a细胞凋亡。