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根据近数十年的研究发现,癌细胞在发生发展过程中产生许多明显的代谢通路以及生化过程的恶性转化,例如糖酵解的激活,瓦伯格效应（Warburg effect）等,使得癌细胞在不利环境下依然能存活甚至快速增殖,与此同时也暴露了癌细胞的脆弱点:由于癌细胞的快速增殖,细胞本身需应对较高压力的代谢速率,则使癌细胞高度依赖某些生化通路,而正常细胞不依赖或者依赖度较低。大量研究发现,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）作为正常代谢过程中的一种副产物,在癌细胞中产生的速率以及累积程度都远高于正常细胞。ROS会对细胞内生物分子产生严重的毒副作用,例如使DNA链内插入被氧化的三磷酸鸟嘌呤核苷酸（8-oxo-d GTP）而导致G:A错配,大量的此类突变会造成生化以及代谢改变,严重时有极大的细胞毒性使细胞致死。鉴于癌细胞需应对如此高水平的ROS压力,则相对于正常细胞对ROS的耐受性较低,因而外加升高癌细胞内ROS水平的药物或者削弱癌细胞抗氧化能力可作为开发广谱抗癌药物的研究方向。紫草是一种在中国有漫长的使用历史的传统中药材,对于治疗各种烧伤、疱疹等具有良好的治疗作用。其主要提取物之一紫草醌被大量发现具有抑制硫氧还蛋白还原酶,抗菌,免疫调节等功能,而对于另一种主要提取物之一的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁（以下简称阿卡宁或DAL）研究很少,对其主要作用尚无明确的发现。目前临床上对肿瘤细胞的化疗法多为抑制细胞DNA复制、靶向抑制关键的调控因子等作为有效的治疗方式,具有低毒、高效、强特异性等特点。但随着临床应用的增多,癌细胞突变较高等原因,耐药性出现的几率也越来越大,而药物剂量的增加又会带来严重的毒副作用。为了克服这一现象,现代医学研究利用癌细胞相对正常细胞突变多、增殖快、高代谢等特点,着眼于联合用药-同时阻断几个通路的作用,以求达到两种或多种药物协同致死癌细胞同时该影响又在正常细胞的耐受范围内。该种方式在细胞水平以及临床试验中均取得很好的疗效,因而成为如今看该研究的热点方向之一。本次研究主要以结肠癌细胞SW480作为实验对象探究DAL对于癌细胞的作用和机理,然后选取非致死浓度联合靶向抑制剂ABT-263（以下简称ABT）达到协同致死癌细胞的作用,在多种癌细胞上验证其联合作用并探究机理。首先通过MTT实验用DAL处理SW480 48 h可测得其细胞毒性程度(IC50=3.9μM),选取非致死浓度2μM作为研究浓度可发现DAL可引起SW480细胞在短短3 h内累积较高水平的ROS,并且随时间加长而增高,同样的处理对人正常细胞胚肾细胞LO2却影响很小。SW480细胞中ROS的累积也引起了DNA链中8-oxo G插入大量增多,进一步导致DNA双链断裂（Double Strand Breaks,DSBs）增多（γH2A.X累积明显）,DNA损伤应答通路（DNA Damage Response,DDR）激活（CHK1磷酸化水平升高）,而加入氧化抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）可将该种现象阻断。应用非致死浓度3μM处理SW480细胞,通过集落形成实验发现随着处理时间的加长细胞增殖受到抑制,通过β-半乳糖苷酶（β-gal）染色实验发现,随着DAL处理时间的加长可以使β-gal阳性细胞大量增多,因而证明DAL可引起SW480细胞衰老发生。其次,我们选择应用衰老细胞清除剂ABT-263联合DAL作用于SW480细胞,发现二者具有很好的协同致死作用,并且通过集落形成实验得到验证。计算二者联合的联合指数（combination index,CI）可以发现,多个联合方式的CI值均低于1,证明该两种药物具有良好的联合致死作用。随后想探究是否该种作用效果具有广谱的联合致死作用,于是应用DAL联合ABT作用于其他7种癌细胞和正常细胞,结果发现会分成敏感和不敏感两组。接着测两组细胞本身抗凋亡蛋白MCL1,BCL-2,BCL-XL发现,敏感组的细胞这几种蛋白的表达水平均很高,而不敏感组的细胞这几种蛋白表达水平均较低。因而表明该种联合作用对于较多依赖抗凋亡蛋白的癌细胞上有更好的效果。紧接着我们发现联合用药时会比单药造成更多53BP1以及γH2A.X的聚集,以及更长的彗星拖尾,表明发生更多比例的DSBs,并且由DSBs引发cleaved caspase 3阳性细胞比例增多,JC-1染色绿色荧光增多,以及cleaved caspase 3蛋白上调,由此证明DAL联合ABT造成的DSBs可诱发细胞凋亡,这是致死癌细胞的机理所在。以上的研究结果综合表明低剂量的DAL即可引发的癌细胞内ROS大量累积是其选择性对癌细胞有毒性作用的基础,而由于氧化的核苷酸分子插入DNA双链导致DSBs的产生但不致死是由于激活了细胞衰老使癌细胞得以存在。当联合应用衰老清除剂ABT时可协同性使细胞内DSBs显著升高激活细胞内源性凋亡通路而致死癌细胞,且该联合作用对于高表达抗凋亡蛋白的细胞具有更好的作用效果。这些发现可为进一步开发DAL药用价值以及联合用药达到更广普的抗癌效果提供参考。