蓝莓LAR、ANS、ANR植物表达载体构建及其转基因研究

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本研究以原花青素含量较高的兔眼蓝莓‘灿烂’(V.ashei‘Brightwell’)和原花青素含量较低的北高丛蓝莓‘赫伯特’(V.corymbosum‘Herbert’)为实验材料,克隆了其叶片中的原花青素合成酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)、花青素合成酶(Anthocyanin synthase,ANS)基因,分别命名为VaLAR1、VaLAR2、VaANS和VcLAR1、VcLAR2、VcANS。通过序列分析得知两种材料相应同源基因仅有少数几个碱基位点的差异,相似性达99%;通过构建系统进化树得知上述基因与茶树的遗传距离最近。以来自‘赫伯特’的VcLAR1、VcLAR2、VcANS、VcANR(王丽金克隆)为目的基因,分别构建了烟草脆裂病毒(TRV)载体,通过农杆菌转化‘赫伯特’组培苗,对VIGS介导的‘赫伯特’组培苗基因沉默体系进行初步探索。结果表明,VIGS介导‘赫伯特’组培苗沉默最佳体系为:农杆菌菌液浓度OD600值2.0,侵染时间为4 min,黑暗培养3 d后转移到光下,4周后采集样品进行检测。本实验成功沉默了‘赫伯特’组培苗VcLAR1基因,使其表达量下降,同时检测到其叶片中原花青素含量下降。以来自‘灿烂’的VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR为目的基因,分别构建植物双元载体pCAMBIA 1302的重组质粒,通过农杆菌转化来自‘赫伯特’组培苗的外植体,探究了其遗传转化体系。通过筛选,确定了‘赫伯特’外植体潮霉素(Hyg)抗性特点;通过正交实验,确定了‘赫伯特’最佳农杆菌侵染体系为:农杆菌浓度的OD600值为0.7、侵染时间为10 min、黑暗条件共培养6 d;目前获得了转VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR基因的‘赫伯特’抗性愈伤。
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