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目的HBV宫内感染的发生主要与病毒本身、母体和胎儿的免疫状况、胎儿的易感性、及胎盘因素等有关。而HBV感染的患者体内存在着不同的HBV病毒株,呈现“相似株”的现象,即一异质性群体。国内学者倾向于从研究病毒如何突破胎盘屏障入手来探讨宫内传播的机制,但对于乙肝病毒本身的结构及其突变所造成的编码产物不同是否影响宫内传播的研究不够系统。介于宫内传播确切的传播机制仍不很清楚,因而有必要从HBV基因结构入手,着眼于这一异质性群体,运用了分子生物学的技术方法,结合临床流行病学的资料,分析HBV基因的变异,以及变异所带来翻译产物的不同来初步筛选可能与宫内感染有关的特异性基因结构,探讨HBV基因异质性与宫内感染的可能关系,从而为阻断HBV的宫内传播提供有效的理论依据。方法①收集2001年11月～2009年7月于太原市第三人民医院足月分娩的1622例HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血,剔除母儿血清缺失,筛选其中HBsAg和HBV DNA均阳性孕妇且其新生儿HBV DNA阳性的母婴对,共22对。根据克隆测序的要求(HBV DNA拷贝数≥105),最终筛选8对母婴对作为宫内感染组,同期收集HBsAg和HBV DNA均阳性母亲但其新生儿HBV DNA阴性的8例母亲纳入宫内未感染组。②提取血清中HBV DNA,分别扩增宫内感染组8对母婴和未感染组8例母亲HBV DNA前S/S区1.2kb基因片段及前C/C区909bp基因片段,经PCR产物纯化后克隆入pUCm—T载体,最后经PCR酶切鉴定、测序,共得到宫内感染组6对母婴、宫内末感染组3例母亲前S/S区86株HBV序列及宫内感染组6对母婴、宫内末感染组3例母亲前C/C区67株HBV序列,采用Lasergene中Megalin功能对测序结果较好的82株HBV前S/S基因及67株HBV前C/C基因全部序列进行分析,确定基因型并构建种系进化树,比较宫内感染组前S/S区核苷酸序列与各基因亚型标准序列的相似率。③比较发生宫内感染的6对母婴间前S/S区基因相似性的高低以及种系进化关系；比较母亲和婴儿间各克隆株的相似率,并判断相似率的高低；最后比较6对母婴间前S/S区及前C/C区HBV序列间基因位点的不同。④分别比较宫内感染组母亲和未感染组母亲、宫内感染组新生儿和未感染组母亲之间核苷酸序列的差异。⑤比较不同基因型的宫内感染率,进而分析HBV基因型与宫内感染的关系；并比较HBV核什酸序列的差异和宫内感染的关系。结果①从6例新生儿(NA-NF)血清中分别扩增得到1.2kb和909bpDNA片段,同时从该6例新生儿的HBsAg和HBV DNA均阳性母亲(MA-MF)血清中扩增得到1.2kb和909bpDNA片段。此外,从同期新生儿未感染的3例HBV DNA阳性母亲(I、J、K)血清中也扩增到1.2kb和909bpDNA片段。②用79株HBV序列的前S/S区和GenBank中A～F基因亚型标准序列的前S/S区构建HBV的种系进化树,并同时用每例样本的各克隆株共82株克隆株与GenBank中A～F基因亚型标准序列的前S/S区构建HBV的种系进化树,其中74株HBV克隆株与C基因亚型的标准序列进化距离最近,宫内感染组母亲的65株克隆株前S/S区的所有核苷酸序列与M12906的相似率最高,平均为96.25%,与A、B、D、E、F基因亚型标准序列的平均相似率分别为91.32%、91.46%、88.45%、87.22%、85.43%,与6个基因亚型间的相似率存在差别(F=98.944,P=0.00)。③将前S/S区的82株核苷酸序列及前C/C区的66株核苷酸序列分别与C基因型的标准序列进行比较,得到每一株克隆序列的相似率,然后求得平均相似率分别为96.5%、98.32%,经t检验分析得此两基因区的核苷酸相似率存在差别(t=-3.096,p=0.007),且核苷酸相似率以前C/C区高于前S/S区。④发生宫内感染的6对母婴HBV前S/S区序列中,每一例新生儿HBV克隆株间的平均差异率各为99.83%、99.83%、99.10%、99.51%、99.61%、96.52%,每一例母亲HBV株的平均差异率分别为99.05%、99.04%、99.39%、99.39%、99.47%、94.69%,新生儿HBVDNA的相似性高于母亲(t=2.119,p=0.088)；前S/S区各母婴对间HBV序列间平均相似率分别为98.81%、99.29%、99.28%、99.45%、99.52%、95.61%母婴HBV序列间一致性较高。分别以每一对母婴核苷酸序列的前S/S区构建种系进化树,可以看出每一对母婴序列间的进化距离都比较小,分别为0.9、2.9、1.2、0.7、0.7、4.9,表明发生宫内传播母婴体内HBV间的进化距离较小,亲缘关系比较接近。且发生宫内传播的母婴序列中,母体内的优势株和新生儿体内的优势株是不完全一样的。其中,MA的优势株在NA中没有检到,ME的弱势株成为NE中的优势株,MB和MD的优势株在新生儿体内出现的频率高。同时发现“a”抗原决定簇(nt524～nt595)内的两个基因位点nt529和nt531发生突变。⑤通过对携带各种HBV基因型的孕妇发生宫内感染的情况分析可得,携带HBVC型孕妇共48例其宫内感染率为64.6%,携带HBV B型孕妇3例其宫内感染率为100%,C型与B型的宫内感染率经统计学检验尚不能认为两者差别(χ2=0.427,p=0.513)。⑥通过对宫内感染组新生儿,宫内感染组母亲和未感染组HBVDNA阳性母亲序列的比较,可以看出克隆株间差异率从未感染组母亲、宫内感染组母亲到宫内感染组新生儿呈现递增的趋势,且其差别具有统计学意义(Fs=26.389,p<0.000；Fc=5.680,p=0.004),同时每个组内前S/S区基因的核苷酸差异率与前C/C区基因的差异率均有差别。结论①本研究共得到前S/S区86条克隆株,在判断基因型别及研究相似率及差异率时剔除了7条测序效果不好影响分析结果的克隆株,最终得到82株克隆株,分析得其中74株属于C基因亚型,8株属于B基因亚型,故可以得出太原地区HBsAg和HBV DNA均阳性的孕妇及新生儿携带HBV基因型以C型为主,B型较少,这一分布符合我国HBV基因型的流行病学空间分布特点。②对发生HBV宫内感染的6例新生儿及其母亲HBV克隆序列间进行种系进化分析,比较序列间相似性和差异性且序列间的变异位点,得到母婴序列间具有同源性并支持了HBV由母体向新生儿的传播方向。且由结果可知：母体内HBV异质性群体中不分优势和弱势群,均可以通过宫内传播感染新生儿,单株感染和混合感染均有发生,且母体内和新生儿体内的优势株并不相同,提示HBV的宫内感染存在选择性。③对3例B基因亚型和51例C基因亚型的孕妇宫内感染情况进行分后,发现B型和C型在宫内感染的过程中不存在哪种基因型更具有宫内感染的优势。④前S/S区和前C/C区的宫内感染组内母亲和新生儿以及宫内未感染组的母亲的序列差异性相比较,可以看到在差异率从未感染组母亲、宫内感染组母亲到宫内感染组新生儿呈现递增的趋势,且其差别具有统计学意义(Fs=26.389,p＜0.000;Fc=5.680,p=0.004).同时每个组内前S/S区基因的核苷酸差异率与前C/C区基因的差异率均是前S/S区的高于前C/C区,且差异具有统计学意义(p<0.01)。⑤通过分别对宫内感染组母婴间,宫内感染组母亲与未感染组母亲以及宫内感染组婴儿与未感染组母亲间的序列比对,初步筛选出系列的变异位点,这些变异以突变为主间或也有缺失与插入,但总体呈现“杂乱”的现象。但是仍然可以看出前S/S区的突变率高于前C/C区的突变率,且发现了S区“a”抗原决定簇(nt524～nt595)内的两个基因nt529和nt531发生突变。