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研究背景和目的诺如病毒(Norovirus,NoVs)为单股正链的小RNA病毒,直径约27~38 nm,是人类急性胃肠炎的主要病原体。其全基因组由3个开放阅读框(Open reading frames,ORFs)组成,长约7.4~7.7kb。ORF2长度约为1.7KD,编码主要结构蛋白VP1,包括衣壳区(S区)和突出区(P区),其中P区又可分为P1和P2两个亚区,P2亚区具有高度变异性,也是NoVs与HBGA受体的结合位点。NoVs传染性强,常在世界范围内引起暴发流行,成人和学龄期儿童为主要感染对象。在全球范围内,诺如病毒感染造成的疾病负担较重。目前认为肠道粘膜上的人类组织血型抗原(Human histo-blood group antigens,HBGAs)是 NoV 感染机体的受体或协同因子,不同NoV基因型与HBGA受体亲和能力不一致。生食双壳贝类等食品被认为是感染NoV导致急性胃肠炎的危险因素,全世界范围内均有因进食牡蛎等海产品导致大规模急性胃肠炎暴发的报道。2012年全球范围内出现GII.4Sydney株导致暴发流行,我国广东省深圳市于2012年7月首次报道。在2014-2015年冬春季一种新型人感染NoV GII.17变异株出现暴发流行,其最先在中国广东、江苏出现,且当时的人群感染暴发流行率已超过GII.4成为优势流行株。NoV GII.3型曾于2015年小范围在广东地区流行,且该养殖区牡蛎NoV污染中,GII 3型是GII型污染的优势毒株。根据NoV近五年流行特点,本研究主要选取NoV GII.4 Sydney株、GII.17型、GII.3型进行P颗粒表达,为后续进行人群血清抗体水平研究提供基础。课题组前期调查结果发现,广东省长沙湾牡蛎养殖区的牡蛎NoV污染率较广东省其他养殖区高,生蚝养殖为这一地区人群的主要职业,且该地居民大多有生食贝类等海产品的饮食习惯,推测该地区人群可能存在反复多次暴露于不同型别NoV的可能。然而,该地区人群急性胃肠炎发病率低,根据课题组前期针对NoV GII.4 VA387株的研究发现,该地区人群血清保护性抗体的病毒阻断能力较普通对照人群高,但该人群血清抗体对NoV近期流行的GII.4 Sydney株,GII.17型,GII.3型的阻断能力未知。牡蛎养殖区人群诺如病毒监测对暴发有预警作用,则该地区人群血清抗体随诺如病毒暴发情况值得关注。本研究根据牡蛎养殖区人群的特点以及课题组前期研究结果,将该地区居民选定为合适的目标人群,同时匹配年龄、性别条件,从广东省抽取普通人群血清标本作为对照样本。利用成熟的大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统表达NoV GII.4 Sydney株、GII.17型、GII.3型P颗粒,检测该地区人群与普通人群针对3种不同型别NoV的血清抗体水平,分析血清中抗体对近年流行的NoV GII.17的阻断效率,并结合前期研究结果筛选出养殖区中血清抗体对NoVs不同型别均具有高阻断能力个体,为筛选广谱的全人源单抗研究提供线索;连续监测该地区人群在广东GII.17型暴发流行前后血清中保护性抗体水平变化,研究NoV感染后保护性抗体持续时间,为NoV疫苗研制提供参考。研究方法1.NoV GII.3型P区域进行重组表达质粒构建及鉴定粪便中提取NoVGII.3病毒RNA,PCR技术扩增P区域。将P区域片段与表达载体pGEX-4T-1双酶切后连接,将连接好质粒转至TOP10感受态细菌中进行扩增。从菌液中提取质粒,提取好的质粒用BamHI、NMTI进行双酶切跑胶鉴定,同时送测序。2.NoV GII.17型、GII.3型P颗粒表达、纯化将上诉鉴定无误的质粒转入BL21(DE3)感受态细菌中,利用原核蛋白表达原理进行NoV P颗粒表达。表达后蛋白带有GST标签,可利用GST层析重力柱对其进行纯化。纯化后用人凝血酶切去GST标签蛋白,得到NoVP颗粒纯蛋白,利用12%SDS-PAGE蛋白电泳以及免疫印迹实验(Westernblot)进行分析鉴定。3.人群中NoV GII.4型、GII.17型、GII.3型三型血清抗体检测以三型不同NoV P颗粒为包被抗原,采用间接酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测养殖区人群以及对照组人群血清中针对不同型别的抗体。利用酶标仪450 nm波长进行检测吸光度,读取OD值,OD450值>0.25即判定为阳性,同时记录OD值。4.养殖区人群唾液HBGA受体型别检测将预处理后的唾液标本包被,采用ELISA法,在各唾液中分别加入不同HBGA型别的单抗。在酶标仪450nm波长处读取OD值,OD450值>0.1即判定为阳性,即可根据加入单抗类型判断HBGA受体型别。5.人群血清抗体阻断NoV GII.17型与HBGA受体结合实验以HBGA型别已明确的B型唾液包被,用体外中和替代模型测定人群血清抗体阻断NoV GII.17型与HBGA受体结合的能力,设置空白对照、阳性对照、阴性对照以计算血清抗体阻断效率。根据个体血清稀释度与阻断率关系拟合曲线,计算个体血清阻断率50%(BT50)时的血清稀释度。研究结果1.GII.3型表达载体的构建以及鉴定质粒PCR鉴定得到6kb左右条带,与阳性对照中已知质粒片段大小相符;酶切产物凝胶电泳显示:所构建的重组质粒被酶切为两条片段,分别为4.9 kb的Pegex-4T-1载体片段和大小约为1000 bp的P区域基因片段,结果与预期相符,表明重组质粒pGEX-4T-1-P-GII.3构建成功。2.GII.17型、GII.3型P颗粒表达及鉴定本次实验表达NoV GII.17型、GII.3型P颗粒,于10%SDS-PAGE中电泳结果示:出现两条明显条带,与Marker比较得大小为63 KD的GST-P particle和36 KD的P颗粒,与预期的P颗粒大小相符。将电泳鉴定后的GII.17 P颗粒、GII.3颗粒分别进行Western blot结果示:分别在大小为63 KD和36 KD位置显示条带,证明研究所用的原核表达系统BL21(DE3)表达的P颗粒具有抗原特异性。3.人群对NoV GII.4 Sydney株血清抗体水平检测结果2015年汕尾人群(N=195)抗体阳性率为100%(195/195),抗体OD值均值为 2.521(95%C1:2.419~2.642),2016 年汕尾人群(N=184)抗体阳性率为 100%(184/184),OD均值为2.583(95%(C1:2.493~2.672),对照人群(N=210)抗体阳性率为 100%(210/210),OD 均值为 2.249(95%Cl:2.151~2.347)。OD 均值差异具有统计学意义(F=12.90;p<0.05)。4.人群对NoV GII.17型血清抗体水平检测结果2015年汕尾人群阳性率为100%(195/195),均值为1.578(95%C1:1.529~1.627),2016 年汕尾人群阳性率 100%(184/184),均值为 0.976(95%C1:0.937~1.015),对照人群阳性率 55.2%(116/210),均值为 0.276(95%C1:0.263~0.290)。OD均值差异具有统计学意义(F= 1219;p<0.0001)。5.人群对NoV GII.3型血清抗体水平检测结果15年汕尾人群阳性率为88.2%(172/195),均值为0.492(95%C1:0.463~0.520),2016 年汕尾人群阳性率 99.5%(183/184),均值为 0.885(95%C1:00.836~0.935),对照人群阳性率 41.9%(88/210),均值为 0.249(95%C1:0.236~0.261)。OD 均值差异具有统计学意义(F=379.9;p<0.0001)。6.能同时阻断NoV GII.4型与GII.17型的血清保护性抗体情况则根据2015年牡蛎养殖区人群实验结果,195份样本中可筛选出对于GII.4 VA387株与GII.17型血清阻断能力BT50时其血清抗体滴度≥200的个体有39人。7.牡蛎养殖区NoV GII.17型保护性抗体两年变化情况2015年1月牡蛎养殖区人群BT50时的血清抗体几何平均滴度为68.45(95%C1:54.4-86.13);2016年12月牡蛎养殖区人群BT50时的血清抗体几何平均滴度为48.49(95%C1:41.30-56.93)。2016年滴度较2015年明显下降,且差异具有统计学意义。(t=3.688;P<0.01)8.不同个体血清抗体滴度两年变化情况连续两年监测53例牡蛎养殖区个体血清保护性抗体阻断NoV GII.17型变化,其中分泌者个体占81.13%(43/53),非分泌个体占18.87%(10/53)。2015年血清抗体阻断试验结果显示非分泌型个体BT50滴度≥200为0%(0/10),BT5o滴度≤16.67滴度为80%(8/10)。分泌型个体中,BT50滴度≥200占48.84%(21/43),BT50滴度≤ 16.67 占 34.88%(15/43)。且 2015 年结果示,在BT50滴度≥16.67(N=28)个体中,有75%(21/28)个体BT50滴度≥200,即大多数人感染诺如病毒后,其血清抗体具有保护个体不发生急性胃肠炎的能力。值得注意的是,这些个体(BT5D滴度≥200)在历经两年后(2015年1月到2016年12月),85.79%(18/21)个体BT50滴度将至200以下,其中5位BT50滴度≤16.67,即血清抗体完全丧失保护能力。研究结论1.NoV GII.17型、GII.3型P颗粒可成功表达且抗原性良好;2.养殖区人群血清NoV GII.4 Sydney株、GII.17型、GII.3型抗体均为阳性,且抗体反应均值水平均比对照人群高,提示养殖区人群较对照人群具有更多NoV暴露机会;3.养殖区人群血清保护性抗体阻断水平较对照人群高,且部分个体血清抗体具备同时阻断NoV GII.4型和GII.17型的能力;4.NoV GII.17型流行季后,人群血清保护性抗体经过两年滴度下降明显,部分人血清抗体失去保护能力。