研究目的：古时记载桑叶有止消渴功效,现代研究表明其为具有潜力的降糖佳品,亟需系统深入的研究。本研究基于口服药物体内吸收代谢的动态过程综合利用中药化学、药物代谢、药理学等学科理论与技术,分别对桑叶吸收前化学组分在肠道内的α-葡萄糖苷酶抑制作用,及吸收后血中化学组分对胰岛素抵抗细胞模型的作用进行逐步研究,并且鉴定桑叶水提物及其含药血清中的化学成分,弥补桑叶降糖研究在血清药理方面的空白。本研究从药效出发,以口服降糖药物作用靶点为基础,精制桑叶有效部位,尝试明确桑叶降糖药效物质基础,为全面阐释桑叶治疗糖尿病的活性化合物及降糖机制取得新突破奠定基础,为桑叶二次开发及发现中药治疗糖尿病新思路提供参考。研究方法：1.使用不同溶剂、提取方式制备桑叶不同提取部位：总水提部位(WE)、水提上清部位(AP-A)、水提沉淀部位(AP-P)、75%乙醇提取部位(EE-1)及水提后滤渣醇提部位(EE-2)并通过建立HPLC化学特征图谱对其化学成分进行初步表征；2.经大鼠小肠获得α-葡萄糖苷酶,以4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物,对酶浓度、底物浓度、反应时间等条件进行了优化,建立a-葡萄糖苷酶体外活性评价体系,并以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照,研究上述桑叶不同提取部位对肠道内降糖靶点α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；3.采用大鼠在体封闭肠环法对桑叶水提物肠道吸收成分进行初步锁定,使用大孔吸附树腊尝试富集桑叶吸收组分。此外,制备桑叶含药血清,获得桑叶吸收后血中化学组分,采用HPLC对桑叶水提物及大鼠血清样品进行分离,静电场轨道阱组合式高分辨质谱仪进行在线离子检测、二级碎片离子扫描,对桑叶水提物化学成分及其含药血清中的化学成分进行鉴定；4.以诱导分化形成成熟肌管的C2C12骨骼肌细胞为研究材料,采用棕榈酸(PA)及胰岛素(INS)诱导建立胰岛素抵抗(IR)细胞模型,使用不同浓度桑叶含药血清进行干预,以葡萄糖氧化法检测糖消耗量研究桑叶吸收入血组分对胰岛素抵抗的作用。研究结果：1.桑叶不同提取部位得率分别为WE:21.44%, AP-A:15.95%, AP-P:9.02%, EE-1: 16.06%, EE-2:3.50%o对桑叶上述提取部位化学成分HPLC化学特征图谱进行了对比研究,结果显示在此检测条件下,WE中化学成分较EE-1多,AP-A中的化学成分较AP-P多,EE-2所获得的成分最少；2.建立了体外a-葡萄糖苷酶活性测定反应体系,对桑叶不同提取部位的α--葡萄糖苷酶活性抑制作用进行了评价,结果显示不同提取部位的半数抑制浓度(IC50)分别为WE:0.08g·L-1; AP-A:0.17g·L-1; AP-P:0.42g·L-1; EE-1:0.12 g·L-1;a-葡萄糖苷酶抑制活性强弱顺序为：WE>AP-A>EE-1>AP-P,其中WEICso小于Acarbose(0.11 g·L-1)抑制活性最高；3.对桑叶水提物肠吸收成分初步锁定,结果显示桑叶水提物中有8个成分(C2、 C3、C5、C6、C9、C12、C13、C15)以原型吸收。桑叶中多数成分在吸收过程中可能被肠壁酶代谢,并发现4个肠壁代谢产物(X1、X2、X3、X4)。使用大孔吸附树脂没有达到将吸收成分与未吸收成分彻底分离的目的,因此,通过制备含药血清对桑叶入血成分进行富集。从桑叶水提物中鉴定了14个化学成分,分别为异绿原酸,5-(p-D-吡喃葡糖基)-2-羟基苯甲酸,咖啡酸,5,7-二羟基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,对豆酸,绿原酸,槲皮素-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃糖苷,芦丁,金丝桃苷,异槲皮苷,无梗五加苷B,紫云英苷,异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。从含药血清中鉴定了26个化学成分,多数为上述化合物的代谢产物。其中可能来源于绿原酸、咖啡酸、对豆酸的代谢产物有8个,可能来源于5,7-二羟基香豆素的代谢产物9个,可能来源于槲皮素的代谢产物4个,可能来源于异鼠李素的代谢产物4个,可能来源于山柰酚的代谢产物1个。4.使用0.125 mmol-L-1 PA单独诱导C2C12细胞48 h糖消耗量较正常组显著降低(P<0.05),换上含有胰岛素的正常培养基培养24 h后PA组细胞在胰岛素刺激下的糖消耗量显著低于正常组(P<0.05)。此外,0.125 mmol-L-1 PA与1 nmol-L-1 INS共同诱导48 h后细胞糖消耗量与胰岛素组比较显著降低(P<0.01),上述方法可诱导C2C12细胞产生胰岛素抵抗。20%以下桑叶含药血清培养C2C12细胞48 h后对细胞活力无显著性影响,并且可提高正常细胞的糖消耗量,20%含药血清使正常细胞糖消耗量升高21.31%,差异显著(P<0.01)；20%含药血清干预PA单独诱导的IR细胞糖使其糖消耗量升高18.48%,有统计学意义(P<0.01),换上含有胰岛素的正常培养基培养24 h后,显著增加胰岛素刺激下的糖消耗量(P<0.01),增加率为20.74%。此外,20%桑叶含药血清可改善PA与INS共同诱导的IR细胞糖消耗量(P<0.05),增加率为6.58%。结论及意义：水提取可以获得桑叶中大部分化学成分,进一步醇沉可以达到精制桑叶水提物的作用,水提醇沉为本实验研究中桑叶的最佳提取方式。桑叶吸收前化学组分对肠道内降糖靶点作用研究显示,桑叶水提部位表现出最强的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。对桑叶吸收入血组分降糖作用研究显示20%桑叶含药血清对棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗有良好的改善作用。本实验从水提物中鉴定的化合物多为黄酮类、酚酸类等成分,从含药血清中鉴定的化合物主要为上述化合物的代谢产物,这些代谢产物可能是桑叶直接改善胰岛素抵抗的直接物质基础。该实验弥补了桑叶含药血清降糖药效研究的空白,为桑叶降糖物质基础及药效机制的深入研究奠定了基础。研究结果显示桑叶中原型成分及其代谢产物通过不同的降糖靶点发挥作用,后期可进一步对桑叶抑制a-萄糖苷酶活性、改善胰岛素抵抗的作用机制及有效化学成分进行深入的结构及量效关系研究。结合已有研究结果,尝试为实现药效-机制-物质基础相关联的降糖中药研究模式奠定基础,对桑叶的二次开发及研究疗效好、副作用小的降糖药物有着重要意义。