心房颤动（Atrial fibrillation,AF）是临床上最常见的心律失常之一,已经日益引起全球的关注。房颤的患病率和死亡率呈现出年龄依赖性,年龄越大发病率越高,同时可引发严重的并发症如动脉栓塞和脑卒中,已经严重威胁到人类的生命健康。尽管目前对房颤的研究不断深入,但治疗效果并不理想。如果能够深入探究房颤的发生发展过程,从分子水平研究其发病机制,寻找合适的干预治疗靶点,将对于房颤的诊治有着重要的意义。随着科技进步,高通量测序的出现以及生物信息学的运用,越来越多的基因信息被人们所挖掘并熟知。比较突出的是近些年来非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）的出现逐渐受到研究者的关注。有研究表明,在人类转录本中,用于编码蛋白的基因仅占2%,剩余的98%均为非编码RNA,包括r RNA、t RNA、mi RNA、Lnc RNA等,它们的共同特点是从基因组转录而来,但不翻译成蛋白质,仅在RNA水平行使相应的生物学功能。一般将核苷酸序列大于200nt的nc RNA定义为长链非编码RNA（Long no-coding RNA,Lnc RNA）,将核苷酸序列大小介于19-25之间的定义为微小RNA（micro RNA,mi RNA）。越来越多的研究证实Lnc RNA和mi RNA均参与了机体的各项生命活动,包括个体生长发育、细胞损伤修复、肿瘤迁移侵袭,以及各种心脑血管疾病、神经系统疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病的发生发展等。近年来大量研究发现,非编码RNA的异常表达在心血管系统疾病包括房颤的发病过程中发挥着重要作用,其已逐渐成为心血管基础和临床研究的一个新的热点和重点。Lnc RNA心肌梗死相关转录本（myocardial infarction association transcript,MIAT）最早是在心肌梗死患者中发现并命名的,有学者发现lnc RNA-MIAT的表达与心肌肥厚、心肌纤维化、心室重塑、心脏射血分数密切相关。大量研究证实心房肌纤维化、心房重构是房颤发生和维持的重要机制之一,因此我们推测Lnc RNA-MIAT在房颤中可能起一定作用。mi R-133a是心脏中含量最丰富的mi RNAs之一,已有研究表明mi R-133a-3p在房颤等心血管系统疾病中发挥着调节作用,由于前期预实验证实了Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p存在靶向结合关系,因此本研究选择Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p作为研究对象,检测它们在房颤大鼠模型中的表达情况,并通过调控它们的表达水平分析Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p信号轴对于房颤发生发展以及心房重构的影响,希望能为房颤的分子靶向治疗提供新的理论依据。同时本研究分析Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p在房颤患者血液中的表达情况,并结合房颤患者的临床病理特征及超声心动图指标,探讨两种RNA与房颤及心脏功能的关系,以期为房颤的预测、早期诊断和治疗提供新的思路。本研究分为三个部分:第一部分Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p对房颤大鼠的作用机制研究;第二部分Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p对房颤大鼠心房重构的作用研究;第三部分房颤患者中Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的表达分析及其临床意义研究。第一部分Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p对房颤大鼠的作用机制研究目的:心房颤动是临床上常见的心律失常之一,且随着年龄增长发病率不断增加。房颤可增加血栓栓塞疾病、脑卒中、心力衰竭的发病率,严重影响患者的生活质量。有研究表明非编码RNA可能参与了房颤的发病过程,本研究通过诱导房颤大鼠的动物模型,并构建靶向Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的慢病毒,将慢病毒注射到房颤大鼠的右心房,探讨Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p分子轴对于房颤的影响以及可能的机制。方法:1.实验动物分为6组,分别为Sham、AF、AF+sh Control、AF+sh MIAT、AF+sh MIAT+anti-mi R-Control、AF+sh MIAT+anti-mi R-133a-3p。除Sham组和AF组外,其余组注射相应的慢病毒及对照各10μl,Sham组和AF组大鼠注射相同体积的溶剂。注射48h后,采用q RT-PCR法检测各分组中Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p基因的表达水平,验证病毒效果。2.验证慢病毒转染成功后,使用经颈静脉电刺激法诱导大鼠房颤发生,心电图观察到P波消失,出现稳定的f波且RR间期不等则视为模型成功。每周刺激一次,连续诱导5周,每周检测各组大鼠的心电图。每周末各取Sham组和AF组大鼠的右心房,经液氮速冻后至-80℃冰箱进行保存。5周后,q RT-PCR法检测这两组5个时间点Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p基因的表达水平,以第1次检测的Sham组大鼠的表达水平作为基准,绘制基因表达-时间曲线。3.房颤诱导5周后,观察各组大鼠心电图及电刺激诱导房颤持续时间,分析Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p对于房颤的影响。4.应用q RT-PCR法检测房颤诱导5周后各组中Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p基因的表达变化。5.TUNEL染色分析Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p对于心肌细胞凋亡的影响。6.采用双荧光素酶实验验证Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的靶向关系。结果:1.注射慢病毒48h后,Lenti-sh MIAT可以显著降低MIAT的表达水平,Lenti-anti-mi R-133a-3p能够明显抑制MIAT的下降,起到挽救效果,有统计学意义（P<0.05）;注射Lenti-sh MIAT可显著提高mi R-133a-3p的表达水平,注射anti-mi R-133a-3p可抑制mi R-133a-3p的表达水平（P<0.05）。慢病毒转染效果良好。2.诱导房颤5周过程中,Sham心电图正常,AF组则P波消失,出现f波且RR间期不等。绘制的基因表达-时间曲线表明:与Sham组相比,诱导房颤后Lnc RNA-MIAT的相对表达量显著增加,且随着时间的延长Lnc RNA-MIAT的表达呈下降趋势。相反的是诱导房颤后mi R-133a-3p的相对表达显著降低,在Lnc RNA-MIAT下降的同时mi R-133a-3p的相对表达逐渐增加,而且在Sham和AF组的表达具有显著性差异（P<0.05）。3.诱导房颤5周后,分析各组大鼠的心电图,结果显示Sham组出现窦性心律,AF组出现典型的f波、P波消失以及绝对不规则的RR间期。体内敲低MIAT的表达能有效的缩短大鼠房颤的持续时间（P<0.05）,而注射了anti-mi R-133a-3p后能够逆转敲低MIAT的作用效果。4.诱导房颤5周后,q RT-PCR检测结果表明与Sham组相比,AF组中Lnc RNA-MIAT的表达水平显著升高（P<0.05）;注射Lenti-sh MIAT可以明显抑制Lnc RNA-MIAT基因的表达（P<0.05）;注射anti-mi R-133a-3p后又明显地增加了Lnc RNA-MIAT的表达量（P<0.05）。mi R-133a-3p在各组中的表达趋势与Lnc RNA-MIAT相反,AF组大鼠的表达量明显低于假手术组,注射Lenti-sh MIAT显著增加了它的表达,anti-mi R-133a-3p又可以降低它的表达（P<0.05）。5.TUNEL染色结果显示:AF组与Sham组相比,大鼠的心肌细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,而sh MIAT的干预可明显抑制心肌细胞凋亡（P<0.05）;但anti-mi R-133a-3p又可以逆转sh MIAT对心肌细胞凋亡的抑制作用（P<0.05）。6.双荧光素酶实验表明Lnc RNA-MIAT上有两个结合位点可以和mi R-133a-3p进行靶向结合,但是这两个结合序列对Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的相互作用没有协同效果。小结:1.Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p存在靶向结合关系,在房颤过程中发挥重要作用。Lnc RNA-MIAT在房颤大鼠高表达,mi R-133a-3p在房颤大鼠低表达,敲减MIAT后可以缩短房颤持续时间;注射anti-mi R-133a-3p则可以逆转敲减MIAT的效果。2.敲减MIAT可显著抑制房颤大鼠的心肌细胞凋亡;anti-mi R-133a-3p可明显逆转sh MIAT对心肌细胞凋亡的抑制作用。第二部分Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p对房颤大鼠心房重构的作用研究目的:通过检测心房电重构和结构重构中相关标记基因和蛋白的表达,分析Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p信号轴对房颤大鼠心房重构的影响。方法:1.Western blot法检测钠离子通道蛋白Nav1.5和钾离子通道蛋白Kv1.5的表达。2.Masson染色检测各组大鼠的心房组织纤维化。3.分别采用q RT-PCR和Western blot检测纤维化相关基因TGF-β1、CTGF、collagen I和collagen III基因和蛋白的表达变化。结果:1.WB结果显示与Sham组相比,AF组大鼠的Nav1.5和Kv1.5蛋白的表达量都显著降低（P<0.05）;注射sh MIAT后能明显提高这两个通道蛋白的表达水平（P<0.05）;而anti-mi R-133a-3p的干预又能明显逆转敲低MIAT的效果（P<0.05）。2.Masson染色结果显示与Sham组相比,AF组大鼠右心房中胶原含量明显增加,敲低MIAT基因后则明显减轻房颤纤维化。此外,挽救实验表明,anti-mi R-133a-3p可以显著逆转通过敲低MIAT缓解的纤维化。3.q RT-PCR结果显示在AF组大鼠右心房组织中,TGF-β1、CTGF、collagen I和collagen III这4个基因的表达水平明显升高（P<0.05）,抑制MIAT基因表达后可以明显降低它们m RNA的表达水平（P<0.05）。此外,使用anti-mi R-133a-3p干预后,敲减了MIAT基因的房颤大鼠中这几个基因的表达量又显著增加（P<0.05）。WB检测结果和PCR结果一致。小结:1.房颤大鼠中Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p基因表达量的变化可以影响离子通道蛋白Nav1.5和Kv1.5的相对表达量。2.Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p分子轴可以调控房颤大鼠的心肌纤维化。第三部分房颤患者中Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的表达分析及其临床意义研究目的:本研究旨在通过检测房颤患者和志愿者血液白细胞中LncRNA-MIAT和mi R-133a-3p的表达变化,并结合房颤患者的临床病理特征及超声心动图指标,分析Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p与房颤及心脏功能的关系,以此探讨其在房颤中的预测及诊断价值。方法:1.收集80例房颤患者（持续性房颤40例、阵发性房颤40例）和47例志愿者,采用q RT-PCR法检测受试者血液白细胞中Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p的表达水平。2.所有受试者均行超声心动图检查,测定LAD、LAVmax、LAVmin、LAEF、LVEF及E/e’,结合各组受试者的临床特征,分析房颤与Lnc RNA-MIAT、mi R-133a-3p及超声心动图各指标的相关性,并使用二分类Logistic回归,建立多项标志物对房颤的诊断方程,将标志物对房颤进行联合诊断。结果:1.Lnc RNA-MIAT、mi R-133a-3p在持续性房颤、阵发性房颤和对照组血液白细胞中的表达情况分析q RT-PCR结果显示,Lnc RNA-MIAT在持续房颤和阵发性房颤患者血液白细胞中的表达水平均显著高于对照组（P<0.05）,但持续性房颤组与阵发性房颤组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。而mi R-133a-3p的表达趋势与Lnc RNA-MIAT相反,对照组最高,阵发性房颤组较对照组降低,持续性房颤组表达水平最低,三组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。2.房颤与受试者临床特征的相关性分析相关性分析结果显示,性别、年龄、BMI、高血压病史、收缩压水平、Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p表达水平、LAD、LAVmax、LAVmin、LAEF、E/e’均与的房颤发生存在显著相关性（P<0.05）,舒张压水平及LVEF与房颤无显著相关（P>0.05）。Lnc RNA-MIAT、mi R-133a-3p与LAD、LAVmax、LAVmin、LAEF呈显著相关性（P<0.05）,与LVEF、E/e’均无明显相关性（P>0.05）。3.房颤与相关因素回归分析回归分析结果显示,mi R-133a-3p、LAD和LAVmin在房颤的logistic回归诊断方程存在显著意义（P<0.05）,而Lnc RNA-MIAT在房颤的logistic回归诊断方程无显著意义（P>0.05）。小结:1.Lnc RNA-MIAT在房颤患者中高表达,mi R-133a-3p在房颤患者低表达,两者的表达水平与房颤发生及左房功能密切相关。2.mi R-133a-3p可作为潜在的房颤预测和诊断的新型标记物。结论:1.Lnc RNA-MIAT和mi R-133a-3p存在靶向结合关系,在房颤发生过程中发挥调控作用。敲减MIAT可以明显缓解房颤,缩短房颤持续时间。敲减MIAT可显著抑制房颤大鼠的心肌细胞凋亡。2.Lnc RNA-MIAT/mi R-133a-3p信号轴可以影响房颤大鼠的心房重构。3.Lnc RNA-MIAT在房颤患者中高表达,而mi R-133a-3p则在房颤患者中低表达。两者的表达水平与房颤发生及左心房功能密切相关。mi R-133a-3p可作为潜在的房颤预测和诊断的新型标记物。