目的:　　 卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,死亡率居妇科肿瘤之首。化疗是目前治疗卵巢癌的重要手段之一。常用的化疗方案为紫杉醇联合顺铂。紫杉醇的化疗耐药也是影响晚期卵巢癌患者预后的主要原因之一。卵巢癌耐药的发生及逆转机制已成为当前妇产科学界极其紧迫而重要的研究课题。　　 目前研究相对清楚的紫杉醇耐药机制主要包括以下几个方面:1、某些转运蛋白基因过度表达以及细胞信号转导通路的激活。2、β微管蛋白的基因以及蛋白表达的改变。3、细胞凋亡相关蛋白或细胞周期调控蛋白的基因表达异常,如抗凋亡蛋白表达上调,促调亡蛋白表达下调等。4、紫杉醇耐药相关基因过表达等。尽管目前对耐药机制研究已经相对深入,但是对临床的指导意义和应用价值却很有限。故有必要探索新的耐药相关分子,为进一步研究紫杉醇耐药机制奠定基础。　　 目前通过基因芯片表达谱研究发现,在化疗耐受的卵巢癌组织和细胞中存在内质网固有蛋白ERp57(又名GRp58,PDIA3)的表达变化,ERp57的表达与化疗耐受相关。ERp57蛋白属于内质网上的分子伴侣,为蛋白质二硫化物异构酶(PDI)成员之一,是由两个无催化作用的结构域组成的蛋白质。ERp57主要以分子伴侣的形式定位于内质网上,参与蛋白质的正确折叠和糖蛋白的质量控制,此外,ERp57在细胞质和细胞核中也有表达。定位于细胞质中的ERp57与Stat3激活的细胞信号转导和转录调节密切相关;而定位于细胞核中的ERp57则在细胞对抗肿瘤药物的细胞毒性响应中起到重要作用,尤其是核苷酸类似物对DNA损伤作用的响应。ERp57作为一种应激蛋白,在低糖、低氧、低Ca2+等应激状态下大量表达以维持内质网的稳定,保护细胞。　　 近年来的研究发现二硫键异构酶表达不仅仅与肿瘤的侵袭转移有关,也同样参与了肿瘤的耐药性获得过程。ERp57在卵巢癌、B细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、乳腺癌、宫颈癌细胞的化疗耐药形成起到了重要作用。LuciaCicchillitt等通过蛋白质二维电泳分析了卵巢癌耐药细胞株及敏感细胞株中的差异蛋白,ERp57是101个差异蛋白中差异最明显的一个。ERp57与β-Ⅲtubulin和β-actin等细胞骨架相关蛋白形成复合物,在耐药细胞起到了对细胞骨架相关蛋白的折叠和氧化还原作用,调节了微管与染色体的结合,也对纺锤体的动力学组装中发挥作用。　　 为明确ERp57与紫杉醇耐受的关系并进一步探索ERp57在卵巢癌细胞对紫杉醇的获得性耐受过程中的作用,我们利用获购的稳定耐受紫杉醇的卵巢癌细胞株(耐药细胞株中ERp57蛋白表达上调),应用免疫印迹方法观察紫杉醇作用后的耐药卵巢癌细胞与其亲本细胞内ERp57蛋白的表达改变,并通过SiRNA干扰技术下调ERp57,以改变ERp57表达水平,观察ERp57表达水平改变后原细胞对紫杉醇敏感性的改变,旨在为临床预示卵巢癌的治疗反应和治疗卵巢癌提供新靶点。并通过体外试验进一步探讨其在卵巢癌耐药中的机制,以期为卵巢癌耐药临床治疗提供理论依据和实验基础。　　 研究内容及方法:　　 1、用MTT法测定细胞生存率,计算卵巢癌耐药细胞株skov3/tax和oc3/tax细胞的耐药性,并比较敏感细胞skov3和oc3与对应耐药细胞skov3/tax和oc3/tax细胞形态、生长曲线及群体倍增时间的差异。　　 2、采用Westernblot方法检测敏感细胞skov3和oc3与对应耐药细胞skov3/tax和oc3/tax的ERp57表达水平及诱导中表达变化趋势。　　 3、卵巢癌紫杉醇耐药相关候选因子ERp57的功能研究。利用化学合成的ERp57基因特异性SiRNA,转染紫杉醇耐药细胞株,利用Westernblot和RealtimePCR检测ERp57的表达情况。MTT法检测耐药性的变化。利用RealtimePCR检测MDR-1和MRP-1的表达。流式细胞仪检测P-gp底物罗丹明123荧光强度变化。　　 研究结果:　　 1、MTT法测定的结果显示,紫杉醇耐药细胞株skov3/tax和oc3/tax的耐药指数分别为4.01±0.62和4.11±0.22。细胞形态比较显示耐药细胞skov3/tax和oc3/tax的多形核、畸形核细胞较其对应的敏感细胞常见。细胞生长周期的结果提示耐药细胞周期中G0-G1期比率增加,S期比率减少,差异显著,M期细胞比率变化不大。耐药细胞的群体倍增时间为36h,较敏感细胞增加了1.52倍。　　 2、Westernblot检测结果表明耐药细胞株skov3/tax和oc3/tax的ERp57表达水平均较敏感细胞上调。以紫杉醇IC50浓度处理skov3细胞,在5分～120分的不同时间点,检测ERp57表达水平有轻度增加。Skov3细胞在%倍～4倍浓度紫杉醇作用24小时后,随紫杉醇浓度增加,ERp57表达量逐渐增加。Skov3/tax细胞在1/8倍～2倍IC50紫杉醇浓度作用下,ERp57表达低于本底的表达水平,当浓度继续增加至2倍和4倍IC50紫杉醇浓度,ERp57恢复本底水平。　　 3、ERp57-SiRNA降低ERp57表达水平后,利用Westernblot和RealtimePCR验证了干扰成功。降低ERp57表达水平能够提高耐药细胞的紫杉醇敏感性。RealtimePCR检测到了,降低ERp57表达水平同时MDR-1和MRP-1的表达降低。流式细胞仪结果显示,降低ERp57表达水平能提高耐药细胞中P-gp底物罗丹明123的平均荧光强度,即抑制了P-gp介导的罗丹明123的外排。　　 研究结论:　　 1、耐药细胞skov3/tax和oc3/tax与敏感细胞的生物学形态有明显差异,MTT测定的耐药指数很好的说明了耐药细胞的耐药特性。　　 2、降低ERp57表达能够提高耐药细胞skov3/tax和oc3/tax对紫杉醇的敏感性,可能通过降低转运蛋白对药物的外排起到逆转耐药的作用。