研究背景:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,在临床上由疾病引起的死亡率中仅次于心血管系统疾病。寻找高效、低毒、副作用少的抗肿瘤药物是当前药物研发的重点领域,近年来研究发现肿瘤的发生与蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase,PTK)的异常活化紧密相关。该激酶是目前已知最大的蛋白超家族,是一类催化ATP上γ位磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白的酪氨酸残基磷酸化,在维持细胞的生长、分化中起重要作用。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是受体型酪氨酸激酶家族之一,它包含EGFR1(HER1、c-erbB1),HER2(EGFR2、c-erbB2),HER3(EGFR3、c-erbB3),HER4(EGFR4、c-erbB4)等四种亚型。EGFR基因定位于7p11-13,该基因转录出含有1186个氨基酸残基的跨膜糖蛋白。EGFR分为胞外区、跨膜区和胞内区三个区域。EGFR的胞外区包含两个对表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)具有高度亲和力的配体结合区,和两个半胱氨酸富含区。胞外区存在12个N-糖苷键连接的糖基化位点,这些位点的糖基化可以影响EGFR与配体的结合以及EGFR激酶的二聚化。跨膜区是由23个氨基酸残基构成的单链α螺旋结构,将受体固定于胞膜上,通过范德华力和氢键介导EGFR激酶在膜上的二聚化以及与其它膜蛋白相互作用。胞内区域由542个氨基酸残基组成,是EGFR的激酶区。可分为3个亚区,即近膜区、酪氨酸激酶区和C-末端区。近膜区是介导EGFR胞内二聚化的重要区域。酪氨酸激酶区根据与ATP结合部位的不同分为铰链区、溶剂区、疏水区。铰链区是指与ATP的腺苷环结合的部位。溶剂区是指与ATP糖基、磷酸根结合部位。疏水区是调节酪氨酸激酶的催化活性的部位,起始端含有一个DFG(Asp-Phe-Gly)序列,终止端含有一个APE(Ala-Pro-Glu)序列,中间部位是含有三个酪氨酸的环状结构,这种环状结构形成了动态的活化环。C-末端区由229个氨基酸残基构成,至少含有5个酪氨酸磷酸化位点。当EGFR配体例如表皮生长因子(EGF)与EGFR结合时,EGFR发生二聚化,ATP结合EGFR激酶区结合位点,激酶处于活化状态,催化C-末端的酪氨残基发生磷酸化反应,这些酪氨酸残基被磷酸化后,成为信号转导分子和接头蛋白的结合位点,从而激活各种信号分子和下游信号通路,引发细胞增殖、分化、迁移、黏附和抗调亡等多种细胞效应。研究表明EGFR激酶在多种肿瘤都过度表达,如常见的乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等。因此,EGFR激酶活化与细胞内的生物信号转导过程引起研究者的广泛关注。EGFR的配体与之结合诱导单体EGFR分子产生同源二聚体或异源二聚体,触发了EGFR的信号转导,促进ATP与胞膜内的激酶区结合,激活EGFR激酶区活性,导致EGFR二聚体内C-末端区的酪氨酸残基磷酸化,磷酸化酪氨酸成为信号转导分子的结合位点。研究显示,与之结合的信号转导分子包括Grb-2、Nck、Crk、Shc、Src、Chk、PI3K和磷脂酶C等。与EGFR激酶诱导的信号蛋白通路主要包括三条途径,PI3K/Akt途径、Ras/Raf/MEK/ERK途径、STAT3途径。在研究早期,对EGFR蛋白结构尚不清楚,研究者尝试从一些天然产物中寻找EGFR激酶抑制剂,然后改构以期获得生物活性更高、选择性更强、毒性更小、生物利用度更高的小分子化合物。研究者们通过高通量筛选技术,从小分子化合库中,发现了化合物PD0153035这类喹唑啉类杂环化合物,对EGFR激酶的活性具有明显的抑制作用,这个发现使得研究者们将寻找EGFR抑制剂目光投向喹唑啉类杂环化合物,在随后的几年中,涌现出一批喹唑啉衍生物,它们都具有较好的抑制EGFR激酶的作用。通过解析EGFR激酶与喹唑啉类化合物的复合物的晶体结构,揭示喹唑啉环上的N原子与EGFR激酶的铰链区形成氢键,与ATP的腺嘌呤环作用方式相同。这种结合比分子间的共价健结合力弱,所以称为可逆性抑制剂。在临床治疗肿瘤过程中研究者发现这类化合物对于KRAS基因突变的肿瘤无效;对没有突变的位点的EGFR效果不明显;对EGFR激酶靠近ATP结合位点突变的肿瘤有效。相关的解释如下:KRAS基因突变的肿瘤不依赖EGFR信号通路持续活化,就可以增殖、转移及凋亡抵抗;ATP结合位点靠近EGFR激酶突变,如L858R突变,使得这类可逆性抑制剂与EGFR的ATP结合位点的能力增强。这表现出这类化合物在临床上抗肿瘤的局限性。临床研究发现EGFR激酶区域的第790位的苏氨酸(T)突变成蛋氨酸(M)使得肿瘤细胞发生获得性耐药。由于蛋氨酸(M)的侧链形成的空间位阻比苏氨酸(T)大,阻碍了现有的EGFR小分子药物与EGFR激酶区域的结合,使ATP与EGFR激酶区域的结合能力提高,激酶持续磷酸化。因此研究者在设计药物时,用嘧啶环代替喹唑啉环,减小蛋氨酸(M)的侧链形成的空间位阻对药物结合的影响,然后在其分子中引入烯烃和激酶区的溶剂区域的半胱氨酸的巯基形成难以解离的共价键,基于这种药物设计理念,研究出一系列的化合物,例如CO-1686、AZD9291、Afatinib。Afatinib 已获得上市,用于 EGFR 激酶突变(L858R/T790M)的非小细胞肺癌患者。这类化合物由于在分子中引入了能与EGFR激酶区的溶剂区域半胱氨酸巯基相结合的基团,形成难以解离的共价键,相对于通过氢键与EGFR激酶ATP结合位点结合的可逆性抑制剂,结合力更强,因此将这类化合物称为不可逆性抑制剂。从生物电子等排原理分析,这些含氮杂环化合物都可以看作是喹唑啉的生物电子等排体,如酞嗪类、吡咯并[2,3-d]嘧啶类、吡唑并[3,4-d]嘧啶类等衍生物,都具有嘧啶并五元杂环或六元杂环的母核,他们都具有良好的抑制EGFR激酶的活性。基于对EFGR激酶结构及生物学的理解,抑制剂的结构特点的分析,及耐药机制的认识,本论文首先以六元环并嘧啶为核心分子骨架,通过以下四方面的改构,设计一系列的EGFR激酶抑制剂。这四个方面包括:(1)在喹唑啉环加氢键受体,(2)在喹唑啉环上增加氢键供体,(3)针对EGFR激酶区活化环DFG基序在喹唑啉环上4位引入不同大小体积的疏水基团,(4)针对EGFR激酶的疏水区和溶剂区在喹唑啉环上6位引入不同体积和极性大小的取代基。然后通过荧光共振能量转移方法评价设计合成的化合物对EGFR激酶抑制作用,接着选取不同的肿瘤细胞株来评价化合物对肿瘤细胞增殖作用,最后选取活性较好的的化合物采用分子动力学模拟,来验证化合物设计的合理性,为进一步的设计合成高效的小分子抑制剂提供理论依据。一.小分子化合物的设计、分子对接及CLogD预测目的:基于EGFR激酶与ATP结合模式,设计出新型喹唑啉类及类似物。方法:由于蛋白酪氨酸激酶的同源性很高,都存在与ATP结合的位点,相应的抑制剂都是与ATP产生竞争性结合,从而抑制激酶的活性。在现有研究基础上,以喹唑啉环为母核,设计合成结构新颖的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)。利用Suflex-Dock模块进行分子对接研究,MarvinSketch 6.2.0预测化合物的CLogD值。我们借鉴其它受体酪氨酸激酶小分子抑制剂与激酶的作用模式,设计出新型喹唑啉类及类似物,结构通式如下:结果:设计合成的18个新颖的小分子化合物,通过SciFinder(?)化合物结构检索,没有此类型的化合物报道。利用Suflex-Dock模块进行分子对接研究,结果显示,设计的化合物都能进入到激酶ATP结合区,喹唑啉环上的氮原子与激酶铰链区形成氢键,R3能靠近激酶的溶剂区,R2取代芳香基也能伸进激酶的疏水区。Suflex-Dock程序对接打分在5.47-7.98之间,通过MarvinSketch 6.2.0预测18个化合物的CLogD值,指导我们更好地设计小分子化合物,CLogD值均小于5.19以下。二.小分子化合物的合成及波谱表征目的:合成新型喹唑啉类及类似物。方法:以2-氨基-5-溴-苯甲酸或2-氨基烟酸为原料经溴化、环合、氯化、取代、偶联等多步化学反应将设计的18个化物合成完成。最后经过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS 进行表征。结果:用2-氨基-5-溴-苯甲酸或2-氨基烟酸为原料经溴化,环合、氯化、取代、偶联等多步反应,成功合成了 18个化合物,均未见文献报道。目标化合物和其中间体的结构均经过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS进行确认。三.小分子化合物的活性评价目的:检测设计合成的18个化合物对酪氨酸激酶的抑制作用和对肿瘤细胞的生物活性。方法:采用荧光能量共振转移技术研究化合物对激酶的抑制作用;采用MTT法研究化合物对肿瘤细胞株的增殖活性结果:对18个化合物进行ErbB1激酶的活性测试,化合物表现出不同的抑制率,其中有5个化合物在1μmol时对ErbB1激酶抑制率在96%以上。化合物Ⅰ-4 对 ErbB 1 激酶的 IC50 值为 44.1 nM,对 EGFR(ErbB 1)L858R 的 IC50 值 108 nM,呈剂量依赖关系;对HER2激酶IC50值为676nM,对HER4激酶IC50值为801nM。用MTT法对18个目标化合物进行了体外培养的人肿瘤细胞株的细胞增殖活性实验,选取了乳腺癌细胞SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7、BT-474、肺癌细胞株A549,以Gefitinib为阳性药物,结果显示,以上化合物均有较强的抑制肿瘤活性,多数IC50在个位数μM级别。其中Ⅰ-4对乳腺癌SK-BR-3细胞株IC50为 64nM。四.分子动力学模拟目的:进一步阐述了化合物Ⅰ-4与EGFR的结合机理。方法:将化合物Ⅰ-4与EGFR激酶分子对接得到的复合体系中,用Amber12进行分子动力学模拟和自由能计算。结果:对化合物Ⅰ-4与EGFR激酶分子对接得到的复合体系进行分子动力学模拟和自由能计算,根据结合自由能的各个能量项来看,范德华相互作用和非极性溶剂化能是必需有利的结合自由能的贡献。蛋白和配体小分子间存在有利的库仑力相互作用,但被不利的去溶剂化贡献所抵消。结合自由能的分解表明,结合自由能的主要贡献来源于Leu718,Val726,Lys745,Leu788,Thr790,Leu792,Met793,Cys797和Leu844,其中Met793作用能为-2.26899 Kcal/mol,Leu844作用能为-2.32687 Kcal/mol,对小分子配体和受体的结合起重要作用。结论:本文以喹唑啉为先导化合物,利用分子对接、ClogD值预测,设计合成了 18个三种结构类型的化合物。生物活性表明,其中有5个化合物对EGFR激酶单点浓度在1uM时抑制率在96%以上;Ⅰ-4化合物对EGFR激酶活性达到44.1nM;对EGFR(L858R,T790M)无效;对HER2、HER4作用不明显。Ⅰ-4化合物对乳腺癌SK-BR-3细胞IC50=64nM。分子结合自由能计算表明,化合物Ⅰ-4与EGFR作用时,范德华力和非极性溶剂化是形成复合物的主要驱动力。结合自由能分解表明,Met793、Leu844残基的作用对活性贡献最大。