一、研究背景： 恶性胸腔积液是世界范围内一常见临床情况。恶性胸腔积液生长迅速，常引起胸闷、气急、呼吸困难、心慌、不能平卧等症状，如不及时处理可造成患者呼吸循环功能障碍，严重者甚至危及生命：反复出现引起蛋白丢失，贫血，免疫力低下，以及恶液质等。胸膜固定术通过闭锁胸膜腔来限制胸水的集聚，对于生存时间有限的患者来说可以缓解症状，提高生存质量，是一十分可取的姑息治疗措施。在胸膜固定术的实施过程中，胸膜硬化剂的选择十分关键。 胸膜硬化剂有许多选择，效果和不良反应不尽相同。在北美和英国，滑石粉是最常用的胸膜硬化剂，目前其有效率是最高的，但其除了引起发热及胸痛等不良反应外，安全性的问题受到越来越多的关注。研究多次报道了并发急性呼吸窘迫综合征甚至造成患者死亡的情况。其它的胸膜硬化剂还有：四环素及其衍生物、红霉素、博莱霉素、硝酸银、碘化聚乙烯吡咯酮、奎宁以及纤维胶等。目前尚没有公认理想的胸膜硬化剂。 随着分子生物学的发展，转化生长因子(TGF-beta)家族作为极有希望的细胞因子型胸膜硬化剂候选者受到了研究者的关注。TGF-beta具有致纤维化和抑制炎症和调节免疫的活性，其有可能成为新一代的胸膜硬化剂。TGF-beta在人体有三种亚型，TGF-heta 1，TGF-heta 2，和TGF-beta 3。在胸膜的研究中，以TGF-beta 2的研究最为深入。研究发现，TGF-beta 2注入兔或绵羊的胸膜腔能迅速有效引起胸膜粘连，无明显的不良反应，且无明显炎症反应产生。但TGF-beta2胸膜固定术的机制尚不明确，可能的致纤维化机制有：参与胸膜腔内凝血/纤溶系统活性的调节，以及参与基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制剂活性的调节等，从而引起细胞外基质的沉积，形成胸膜粘连。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有促纤维化和促新生血管形成活性的细胞因子。研究发现其可能在滑石粉胸膜固定的过程中发挥作用。滑石粉可以上调人胸膜间皮细胞bFGF的表达水平。bFGF进而通过促进成纤维细胞的增殖等作用引起纤维化效应的产生。TGF-beta 2能否诱导人胸膜间皮细胞bFGF的表达尚未见报道；此外，以往的研究发现，TGF-beta可能参与了各种化学性胸膜固定术的过程，如果TGF-beta 2能诱导人胸膜间皮细胞bFGF的表达，那么bFGF是否可能为各种胸膜硬化剂所致胸膜粘连过程中的一条共同的通路呢?解决这一问题有助于理解胸膜固定术的机制，从而更好地为临床胸膜固定术的实施打下理论基础。 血管内皮生长因子(VEGF)是一种有很强的血管通透性增高效应和促新生血管形成活性的生长因子。研究发现，TGF-beta 2产生良好胸膜固定效应的同时，也伴随大量胸腔积液的产生从而使得引流时间延长，后者可能与VEGF被诱导产生后所发挥的血管通透性增高效应有关；进一步的研究发现，抗VEGF抗体可以减弱TGF-beta 2的胸膜粘连效应，这似乎与VEGF的促血管新生作用受到了抑制有关，因为在应用抗VEGF抗体的实验组，胸膜的新生血管数量低于对照组，且胸膜表面的新生血管数量与胸膜粘连的评分成正比，新生血管的形成是胸膜粘连形成过程的一个重要事件。因此，VEGF可能发挥通过发挥上述两种效应参与胸膜粘连的形成过程。以往的研究都是在动物体内或者以动物细胞为观察对象，本研究尝试在体外培养人胸膜间皮细胞，观察TGF-beta 2对其在VEGF产生方面的效应。另外，bFGF和VEGF都是有促新生血管形成作用的生长因子，二者在新生血管形成方面有协同效应也存在效应的差别，在胸膜固定过程中的二者的相互关系也是我们想要探讨的问题。 因此，本研究的目的是：通过体外培养人胸膜间皮细胞，观察其在不同浓度TGF-beta 2的作用下产生bFGF和VEGF的情况，为进一步研究TF-beta 2胸膜固定术的机制打下基础，为临床更好地实施胸膜固定术提供理论依据。 二、研究方法： (一)人胸膜间皮细胞的取材、分离、体外培养。 人胸膜问皮细胞来源于肝硬化或心力衰竭病人的胸腔漏出液。以含10﹪胎牛血清的DMEM/F12完全培养基在体外进行原代培养，以第二代和第三代细胞为实验细胞。 (二)TGF-beta 2，红霉素对人胸膜间皮细胞的干预。 TGF-beta 2分为三个浓度组：0.05， 0.1， 0.5ng/cm<2>； 红霉素浓度为100mg/l； 只用培养基不加刺激因素为对照组。 细胞长至80﹪融合后，加入无血清培养基先同步化14小时，然后加入干预因素，分别培养4小时，12小时，以及24小时收取细胞培养上清液以及细胞存放于一80℃待下一步实验。 (三)人胸膜间皮细胞总RNA的提取。 按Trizol说明书提取。存放于一20℃待下一步实验。 (四)半定量RT-PCR。 按逆转录试剂盒说明书将细胞总RNA逆转为cDNA。以特异性的引物扩增bFGF基因(468bp)和内参基因β2-微球蛋白(284bp)。2﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。Genetools软件分析目的基因和内参基因表达量(A值)的比值，以此作为bFGF基因表达的相对水平。 (五) 细胞培养上清液中VEGF的ELISA测定。按说明书进行。 (六) 统计分析：实验数据以X士S表示，采用SPSS12.0 for windows作ANOVA方差分析。相关分析采用Pearson’s相关。P<0.05为有统计学意义。 三、研究结果 1.人胸膜间皮细胞的培养。典型的间皮细胞呈鹅卵石外观，大小较为均匀一致，生长状态良好，导致显微镜观察细胞纯度达95﹪以上。在所选取的浓度水平，干预因素对细胞无明显的损伤作用，台盼兰染色细胞存活率计数在98﹪以上。 2.TGF-beta 2和红霉素分别对人胸膜问皮细胞bFGF mRNA表达的影响。 (1)TGF-beta 2 0.1ng/cm<2>在不同时间点对胸膜间皮细胞bFGF mRNA表达的影响：4小时即可检测到bFGF mRNA的表达，随着作用时间的延长，表达量逐渐增加；12小时，24小时表达量分别是4小时的1.67倍和3.57倍，各组之间差异有显著性(P<0.05)。 (2)不同浓度的TGF-beta 2或红霉素作用胸膜间皮细胞12小时，对其bFGF mRNA表达的影响：各组均可见bFGF mRNA的表达，随着TGF-beta 2浓度的增加，bFGF mRNA的表达也增加，各浓度组与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。 3.TGF-beta 2和红霉素对胸膜间皮细胞产生VEGF的影响 (1) TGF-beta 20.1ng/cm<2>对胸膜间皮细胞产生VEGF(pg/ml)的影响：4小时即可在细胞培养上清液中检测到VEGF；12小时，24小时产生水平分别为4小时的4倍和6.8倍，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。 (2) 不同浓度的TGF-beta 2或者红霉素作用胸膜间皮细胞12小时，对其产生VEGF的影响：各组均可检测到VEGF的产生；随着TGF-beta 2浓度的增加，VEGF的产生也增加，各组与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。 4.人胸膜间皮细胞bFGF mRNA表达水平与细胞培养上清液中VEGF水平的相关性：两者呈正相关，相关系数为0.9，相关有统计学意义(P<0.05)。 四、讨论与结论： 1.体外培养的人胸膜间皮细胞可以表达bFGF mRNA和分泌VEGF。在TGF-beta 2的作用下，VEGF和bFGF的产生水平上调，效应呈时间和剂量依赖性。红霉素也有类似效应，可以增加人胸膜间皮细胞VEGF和bFGF的产生。 2.胸膜问皮细胞培养上清液中VEGF和细胞内bFGF mRNA表达水平呈正相关，二者之间可能存在相互作用。 3．TGF-beta 2增加胸膜问皮细胞表达bFGF，后者可能参与胸膜粘连效应的产生，从而可能是TGF-beta 2胸膜固定术的机制之一。 4.胸膜间皮细胞可能积极参与TGF-beta 2胸膜粘连的过程，从而是TGF-beta 2胸膜固定术机制中的重要细胞。