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目的:内脏高敏感是肠易激综合征(irritable bowelsyndrome,IBS)最重要的生物标志,与反复发作的腹痛有关,其具体的分子机制尚未完全明确。前期研究发现,感染后IBS模型鼠肠系膜传入神经自发性放电活动增强,且对机械和化学刺激更为敏感,表明肠神经系统(enteric nervous system,ENS)处于高敏状态,而ENS高敏状态是持续内脏高敏感的关键。中枢海马神经元突触可塑性是中枢记忆形成的标志,与疼痛的中枢致敏有关,是否ENS也有类似形成“记忆”的基础导致ENS持续高敏呢?EphrinB2/EphB2受体酪氨酸激酶分布于突触前后膜,尤其在兴奋性突触中表达,对突触形成和功能维持有重要作用,参与中枢突触可塑性调控。有“肠脑”之称的ENS与中枢存在共性,其突触可塑性的调控是否可能存在相同的通路呢?因此,我们推测EphrinB2/EphB2可能参与调控ENS突触可塑性,使ENS处于高敏状态,产生外周“记忆”,进而参与内脏高敏感的形成。方法:(1)收集正常人及IBS-D、IBS-C患者结肠活检黏膜组织,通过免疫荧光和免疫印迹检测ephrinB2/ephB2在人结肠ENS中的分布和表达,突触可塑性相关即刻早期基因c-fos和arc表达,突触相关蛋白PSD95和Synaptophysin表达,兴奋性谷氨酸转运体VGluT及受体NMDAR表达,及其与腹痛的相关性。(2)采用旋毛虫感染诱导的PI-IBS内脏高敏感模型,分为正常组(NC)、PI-IBS组(VH)和PI-IBS干预组(VH+ EphB2Fc)。模型评价采用HE染色炎症评分评估肠道炎症水平,AWR评分及肠系膜传入神经放电记录评估内脏高敏感状态。通过免疫荧光和免疫印迹/RT-PCR检测ephrinB2/ephB2在ENS中的分布和表达及其与内脏高敏感的相关性,突触可塑性相关即刻早期基因c-fos、arc、bdnf、ptgs2、creb、creme和icer表达。通过透射电镜检测ENS突触囊泡密度,免疫荧光检测ENS突触密度,免疫印迹检测突触前后相关蛋白PSD95和Synaptophysin、Synaptobrevin表达,评估突触结构可塑性。通过免疫荧光和免疫印迹/RT-PCR检测兴奋性谷氨酸转运体VGluT及受体NMDAR表达和磷酸化,评估突触功能可塑性。(3)通过体外LMMP组织培养,并给与EphrinB2-Fc(eB2Fc)活化ephB2信号通路,并分别加入Erk/MAPK通路抑制剂PD98059和U0126、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002 和 PLCγ 抑制剂 U73122、PKC 抑制剂 Chelerytrine、CaMKII抑制剂 KN93,观察ENS突触结构可塑性改变。通过原代ENS神经元培养,观察eB2Fc对ENS神经元纤维新生(初级神经突、次级神经突和神经突分支节点数)、神经元分化成熟和突触萌芽改变。(4)通过体外LMMP组织培养,并给与EphrinB2-Fc(eB2Fc)活化ephB2信号通路,并分别加入Src激酶抑制剂PP2、非特异性NR抑制剂MK801及选择性NR2B阻断剂ifenprodil,观察ENS突触功能可塑性改变。通过原代ENS神经元培养,观察eB2Fc对ENS突触可塑性因子c-fos及谷氨酸诱导的[Ca2+]i的影响。结果:(1)EphrinB2/ephB2相对特异性表达于人体结肠黏膜ENS,而且在IBS-D、IBS-C患者中呈高表达水平。IBS患者结肠黏膜ENS存在明显突触前后可塑性改变。EphrinB2/ephB2表达与IBS患者腹痛症状程度呈明显正相关,且与c-fos水平呈显著正相关。(2)EphrinB2/ephFB2表达于大鼠结肠肌间、黏膜下神经丛及其神经纤维。VH鼠AWR评分增加、疼痛阈值降低,肠系膜传入神经自发放电显著增加且对刺激的敏感性增加;EphrinB2表达、ephB2磷酸化水平显著增加,与疼痛呈相关性负相关。突触可塑性相关即刻早期基因c-fos、arc表达增加。VH鼠存在明显突触结构可塑性,ENS突触密度增加,突触囊泡密度增加,突触蛋白PSD95和Synaptophysin、Synaptobrevin表达增加。VH鼠存在明显突触功能可塑性,NR1、NR2B表达及NR2B磷酸化(Y1472)增加,VGluTl、VGluT2表达增加。EphB2Fc明显阻断VH鼠ENS突触结构和功能可塑性,并改善PI-IBS鼠内脏敏感性。(3)EphrinB2Fc促进LMMP组织ENS突触结构可塑性改变,并且可被PI3K/Akt抑制剂LY294002显著阻断,被Erk/MAPK通路抑制剂PD98059和U0126部分阻断,PLCγ/PKC、CaMKII阻断无明显作用。EphrinB2Fc促进ENS神经元纤维新生(初级神经突、次级神经突和神经突分支节点数增加)、神经元分化成熟(神经突生长的神经元比例增加)和突触萌芽增加。(4)EphrinB2Fc促进LMMP组织ENS突触功能可塑性改变,增加NR2B(Y1472)磷酸化水平,及CREB(S133)磷酸化和c-fos、arc表达水平,并且可被PP2显著抑制。MK801、ifenprodil 显著抑制 CREB(S133)磷酸化和 c-fos、arc 表达水平。EphrinB2Fc促进ENS活化c-fos mRNA表达,增加谷氨酸诱导的[Ca2+]i。结论:EphrinB2/ephB2表达于肠神经元,且与IBS患者腹痛症状程度及IBS模型内脏高敏感明显相关,在ENS突触可塑性调控具有关键作用。EphrinB2/ephB2通过活化下游PI3K/Akt、Erk/MAPK通过参与ENS突触结构可塑性形成。EphrinB2/ephB2通过Src激酶诱导的NR2B磷酸化,介导[Ca2+]i增加并Ca2+依赖的即刻早期基因表达,参与ENS突触功能可塑性形成。