论文部分内容阅读
大豆花色素的合成过程中是由许多基因控制的,其中W4基因控制了大豆花和下胚轴的颜色,编码二氢黄酮还原酶。大豆植株含有野生型的W4基因时,大豆植株开紫色花,下胚轴也是紫色。W4基因突变为纯合隐型w4基因时,大豆植株开白色花,下胚轴是绿色。在大豆不稳定系发现大豆花色和下胚轴的颜色是杂斑（叶片有白色和紫色斑点）。后来证明是由于大豆中的活性转座子Tgm9（Transposon Glycine max）插入DFR2基因导致的。大豆转座子Tgm9的全长约为20 kb,属于CACTA型的活性转座子。由包含有末端反向重复序列的非自主转座子元件和转座酶元件构成。Tgm9有27个外显子以及2个开放阅读框ORF1和ORF2,分别编码转座酶GmTNP2（1060 aa）和GmTNP1（750 aa）。其结构完整,序列明确,但是其转座机制仍然不清楚。将转座酶GmTNP2保守的蛋白序列进行对比发现,GmTNP2与金鱼草Tam1的TNP2有32%的相似性,与玉米En/Spm的TNPD有46%的相似性。因此推测大豆转座子Tgm9的转座机制类似于玉米En/Spm的转座机制。为了验证关于大豆转座子Tgm9转座机制的猜想,本研究主要从两个方面来探究。首先探究转座子在拟南芥中的活性,im（immutans）和gun5（genome uncoupled）突变体作为植物材料,表型容易观察。拟南芥im突变体的表型呈现花斑,叶片由白色组织和绿色组织构成,对光很敏感。叶片的白色部分是由于质体末端氧化酶PTOX（plastid terminal oxidase,PTOX）的缺失导致叶片有白色组织。拟南芥gun5突变体的表型呈现黄绿色。Gun5基因编码了Mg-鳌合酶（Mg-chelatase）的H亚基,在叶绿素生物合成中起作用。T-DNA插入Gun5的AtChlH的启动子区,降低了Gun5基因的表达,导致植株叶片表型偏黄。我们将Tgm9缩短为3种不同片段长度的非自主转座子（dTgm9-1:4.5 kb,dTgm9-2:3.5 kb,dTgm9-3:1.6 kb）。以35S为启动子,PTOX或者Gun5分别作为报告基因,将其分别与3种不同片段长度的非自主转座子元件共同构建在植物双元表达载体上,构建成非自主转座子系载体。再以35S和Ubi7pro为启动子与转座酶GmTNP2和GmTNP1共同构建在植物双元表达载体上,构建成转座酶系载体。利用转基因技术,将非自主转座子系载体和转座酶系载体分别转入im和gun5植株中。转座子在拟南芥中的活性的预期结果分析如下:1、如果转座子在拟南芥中没有活性,则im和gun5植株的表型依然是原来的表型。2、如果转座子在植株的胚胎期跳跃,则im和gun5植株的表型为全绿。3、如果转座子在植株的体细胞期跳跃,则im植株的表型仍然为类似花斑的表型,gun5植株的表型为叶片有绿色斑点或者叶片全绿。第二部分实验是通过烟草瞬时表达来探究转座酶和非自主转座子的相互作用。首先将转座酶（TNP1、TNP2）分别与转录激活因子（VP16）构建在植物双元表达载体中,获得激活表达载体。其次再以TATA为启动子,绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）为报告基因,和转座子末端（Terminal Repeat,TR）共同构建到植物双元表达载中,获得报告基因载体。通过使用激光共聚焦显微镜观察转座酶与非自主转座子的相互作用。实验研究结果如下:（一）转座子在拟南芥植株中的活性:转座酶系植株的筛选与鉴定结果如下:（1）通过潮霉素（HygR）筛选,成功获得30棵gun5背景下的转座酶阳性T1代株系。通过RT-PCR鉴定TNP1和TNP2均可以在gun5植株中表达。（2）通过除草剂（Basta）筛选,成功获得48棵im背景下转座酶阳性T1代株系。通过RT-PCR鉴定TNP1和TNP2也均可以在im植株中表达。非自主转座子系植株的筛选与鉴定结果如下:（1）通过卡那霉素（kanR）筛选,成功获得gun5背景下3种不同长度的非自主转座子系植株,植株的叶片表型都为黄绿色。（2）通过卡那霉素（kan R）筛选,成功获得im背景下3种不同长度的非自主转座子系植株。非自主转座子系植株im-Tn1、im-Tn2的T1代植株叶片表型为花斑,T2代植株叶片表型为花斑或全绿。im-Tn3的T1、T2代植株叶片表型均为全绿。（3）5’RACE转录起始位点预测:非自主转座子系植株im-Tn3的转录起始位点主要在PTOX的5’UTR区,以及转座子的3’末端。（4）缩短PTOX的5’UTR后,通过卡那霉素筛选,成功获得im背景下3种不同长度的非自主转座子系载体。非自主转座子系植株im-Tn1（2）、im-Tn2（2）、im-Tn3（2）的T1代植株叶片表型既有花斑也有全绿。（5）对im背景下缩短PTOX的5’UTR的非自主转座子系植株进行转录起始位点预测,发现转录起始位点确实在转座子的3’末端,使我们更清晰的了解了转座子的结构。gun5背景下跳跃系植株的筛选与鉴定结果如下:（1）经过DNA鉴定成功获得gun5背景下的跳跃系植株（既含有转座酶基因也含有非自主转座子基因）（2）未发现与预期表型相同的转基因植株。（3）可能由于转座子在gun5植株中没有转座或者筛选的转基因植株的数量不够多。（二）通过烟草瞬时表达探究非自主转座子和转座酶的相互作用:（1）成功获得含有VP16和转座酶的激活表达载体（2）成功获得含有非自主转座子末端（3’TIR或者5’TIR）和GFP的报告基因载体。（3）负对照的报告基因载体的TATA可以启动报告基因载体的GFP的表达。