第一部分HBV相关肝癌p16^INK4A/RB途径相关基因异常甲基化目的抑癌基因甲基化、p16^INK4A等基因表达失活和HBV感染均为肝癌形成过程中的常见现象,但他们之间的相互关系并不清楚。本文旨在探讨:（1）肝癌p16^INK4A/RB途径相关基因异常甲基化情况;（2）p16^INK4A/RB途径相关基因异常甲基化形成是否与HBV感染有关。方法采用ELISA法检测HBV感染标志物;用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取组织DNA,用血液微量DNA提取试剂提取术前外周血液中DNA,经重亚硫酸钠转换,将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶,再经纯化,甲基化特异性聚合酶链反应。用甲基化特异性PCR检测抑癌基因甲基化产物;用实时定量PCR检测HBV-DNA和抑癌基因表达水平;用SPSS12.0软件进行统计分析。结果共检测了44例肝癌组织DNA中p14^ARF、p15^INK4B、p16^INK4A和RB的甲基化情况,上述四个基因的甲基化产物检测频率分别为:15/44（34.1%）, 25/44（56.8%）, 31/44（70.5%）和12/44（27.3%）。不同年龄、性别、肿瘤分化程度和临床分期的肝癌患者各个甲基化率没有明显差异。上述基因甲基化以不同频率见于肝硬化组织中,分别为17.1%,28.9%,36.6%和7.3%。从癌旁组织中也检测到5例甲基化阳性产物,其中p16^INK4A4例,p15^INK4B阳性1例,它们均见于HBV标志物阳性的组织中;p16^INK4A阳性4例中有1例见于HBsAg+、HBeAg+,3例见于HBsAg+、HBeAg-的组织中;未检测到p14^ARF和RB基因甲基化产物。肝硬化患者血液中也检测到p16^INK4A、p15^INK4B和p14^ARF甲基化产物,阳性率分别为23.9%、17.4%和6.5%;肝炎患者血液中仅有p16^INK4A、p15^INK4B甲基化产物,阳性率分别为5.5%和5%。正常对照组中未检测到上述基因甲基化产物。HBV感染相关肝癌基因甲基化率高于非HBV相关肝癌,除p14^ARF和RB外,HBV感染相关肝癌组和非HBV感染相关的肝癌组p15^INK4B和p16^INK4A甲基化频率存在显著差异（p<0.05）,而在HBV感染肝癌组内,不同感染状态之间三者甲基化率没有明显差异。经相关分析发现:（1） p14^ARF、p15^INK4B、p16^INK4A甲基化与HBV感染明显相关,特别是HBsAg;（2） p15^INK4B甲基化与p16^INK4A甲基化有一定关系;（3）在上述因素中,HBV感染,p16^INK4A甲基化可能是肝癌形成中重要的因素之一。HBV相关肝硬化患者血液及肝癌患者肝硬化组织和癌组织中p14^ARF、p15^INK4B和p16^INK4A的甲基化率高于非HBV相关的相应样本和基因的甲基化率。HBV-DNA阳性的样本中基因甲基化阳性率,如癌组织中p15^INK4B、p16^INK4A,肝硬化组织和肝硬化患者血液中的p16^INK4A,明显高于HBV-DNA阴性的标本;相关分析显示:HBV-DNA与基因甲基化明显相关(p=0.047 for p14^ARF,0.03 for p15^INK4B,0.002 for p16^INK4A);HBV感染与p14^ARF、p15^INK4B和p16^INK4A的甲基化相关（p分别为0.048,0.035和0.02）,HBV感染标志物中HBsAg、HBV-DNA与上述基因甲基化密切相关（p<0.05）。结论上述结果提示:HBV感染可导致抑癌基因p15^INK4B、p16^INK4A启动子异常甲基化,进而导致相应基因表达失活,细胞周期调节失控,肝细胞无限增殖,恶性转化,最后形成肝癌。HBV的这种作用可能是其致肝癌的作用机制之一。第二部分HBV诱导基因甲基化的机制目的肿瘤发生CpG岛超甲基化的确切机制尚不清楚,可能与多种因素有关,包括DNMT（DNA methyltransferase,DNMT）水平,致癌物接触、基因修复缺陷等,其中DNMT是调节甲基化的主要因素。在第一部分发现HBV有促进抑癌基因甲基化作用,但其机制不明。推测:HBV感染可能也通过增强DNMT1、2、3A和3B的表达,而使p14^ARF,RB和INK4家族中某些成员发生异常甲基化。为此,我们分析了肝癌细胞系（HepG3B、Hep G2）、HBV相关肝癌和非HBV相关肝癌患者的癌组织、癌旁组织和肝硬化相关组织中上述四种DNMT的mRNA表达情况。方法提取上述组织RNA后,逆转录为cDNA,用实时定量PCR检测DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、GAPDH和H4表达水平mRNA,将DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B表达水平与GAPDH和H4进行比较。结果肝癌患者硬化组织和癌组织中四种DNMT mRNA水平高于相应非癌组织;在肝硬化组织中DNMT升高呈现选择性,部分病例DNMT1和/或2升高,部分DNMT3A和/或DNMT3B,病例中呈现四种DNMT的随机组合。与非癌组织比较,11/35 （31.4%）肝硬化组织、24/44 （54.5%）癌组织中DNMT1升高,其平均水平也明显高于于非癌组织（p=0.009 for cancerous tissue, p=0.02 for cirrhotic tissue）。肝硬化组织和癌组织中DNMT2平均水平,与非癌组织相比没有显著差异（p=0.12 for cancerous and p=0.35 for cirrhotic tissues）, 8/44（18.2%）癌组织和4/35 （11.4%）肝硬化组织中DNMT2升高。DNMT3A的情况与DNMT1相似,30/44 （68.2%）癌组织和14/35（40%）肝硬化组织中DNMT3A升高,癌组织和肝硬化组织中DNMT3A的平均水平也明显高于相应非癌组织（p=0.005 for cancerous and 0.01 for non-cancerous tissues）。17/44（38.6%）癌组织和9/35（25.8%）硬化组织中DNMT3BmRNA表达水平升高,其平均水平也明显高于相应非癌组织（p=0.03 for cancerous and 0.036 for cirrhotic tissues）。从非癌组织-肝硬化组织-癌组织,不仅DNMTs水平逐步升高,升高的DNMT的种类也呈现逐步增多趋势,从1-2种到2-3甚至4种。不同年龄、性别、分化程度和分级肝癌中DNMTs表达水平没有显著差异（p=0.23 for DNMT1, p=0.45 for DNMT2, p=0.32 for DNMT3A andp=0.36 for DNMT3B）,但在男性患者、低分化和高分期的肝癌患者DNMTs有增高趋势。所有甲基化病例癌组织至少有一种DNMTs表达增加,58 %（ 18/31）有两种表达升高,42 %（13/31）有三种DNMT表达升高。不同病例之间升高的DNMT有所不同,主要是DNMT1,3A和3B.相关分析显示:DNMT1, 3A and 3B与p16INK4A甲基化显著相关（p=0.0013, 0.025 and 0.041）;DNMT1, 3A与p15INK4B甲基相关（p=0.005和0.04）;DNMT1与p14甲基化相关（p=0.034）;但未发现某种DNMT与RB甲基化密切相关（p>0.05）。根据HBV感染状态,将所有组织样品分成两组。一组:在血液或组织中可检测到至少一种HBV感染的标志物,另一组血液或组织中未检测到HBV或HCV感染标志物。HBV感染相关癌组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织（p= 0.001 for DNMT1, 0.006 for DNMT3A and 0.02 for DNMT3B）; HBV感染相关硬化组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平也明显高于非HBV感染相关硬化组织（p=0.007 for DNMT1, 0.008 for DNMT3A and 0.045 for DNMT3B）;即使在非癌组织,HBV感染相关组织中DNMT1、3A mRNA水平明显高于非HBV感染相关组织（p=0.01 for DNMT1,for 0.04 DNMT3A）。DNMT2在所有组织中（p>0.05）, DNMT3B在HBV相关非癌组织无明显差异（p=0.76）。在HBV相关组织进行进一步分组分析,不论是HBsAg+,HBeAg+组、还是HBsAg+, HBeAg-组或其他标志物阳性组,均未发现四种DNMTsmRNA表达水平之间存在显著差异（p=0.48）。与非HBV感染相关肝癌细胞系（HepG2）相比,HBV相关肝癌细胞系（Hep3B）中DNMT1, 2,3A和3B水平高2.0,1.2,3和1.8倍。HBV感染与DNMTs表达相关分析结果显示:HBV感染与DNMT表达(p=0.009 for DNMT1,0.006 for DNMT3A, 0.03 for DNMT3B。HBV感染有关指标中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA与DNMT1表达密切相关（p分别为0.008,0.032和0.006）;HBsAg、HBV-DNA与DNMT3A（p=0.025和0.003）和3B相关（p=0.029和0.008）;HBsAg、HBeAg、HBV-DNA与DNMT2无明显相关（p分别为0.45,0.82,0.098）。结论HBV感染相关癌组织中DNMT1、3A和3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织。DNMT的表达在肝癌患者的硬化组织中DNMT1、3A和3B mRNA也明显高于非HBV感染相关组织;即使在HBV感染相关的非癌组织中DNMT1和DNMT3A表达水平也高于非HBV相关的。这些说明:HBV感染可能刺激DNMT表达,进而促进抑癌基因甲基化。第三部分血清或血浆p16^INK4A甲基化检测在肝癌诊断中的作用目的探讨p16INK4A启动子异常甲基化在肝癌分子诊断中的应用价值。方法用血液微量DNA提取试剂提取术前外周血液中DNA。经重亚硫酸钠转换,将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶,再经纯化,甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）后,检测p16INK4A启动子甲基化产物,并将其敏感度、特异度等指标与甲胎蛋白（AFP）进行比较。结果70.5%（31/44）的肝癌组织DNA存在p16INK4A启动子异常甲基化,其中有29例血浆DNA中也同时检出p16INK4A启动子异常甲基化产物,检出率为90.5%（29/31）,13例癌组织中未检出p16INK4A甲基化的患者其血浆DNA中亦未检测到p16INK4A甲基化产物。肝炎、肝硬化患者血液中也检测到p16INK4A甲基化产物,阳性率分别为5.5%和23.9%、正常对照组中未检测到上述基因甲基化产物。与AFP相比,p16INK4A甲基化的检测在灵敏度、特异性和准确性上略高于AFP。结论血浆p16INK4A启动子甲基化的检测可能作为一种潜在的独立的非侵入性的肝癌分子诊断标志物。第四部分基因甲基化、HBV感染与肝病患者血浆同型半胱氨酸之间的关系目的检测肝脏疾病血浆t-Hcy水平,探讨基因甲基化、HBV感染与肝病患者血浆同型半胱氨酸之间的关系。方法血浆Hcy测定用化学发光法,试剂为美国ABBOTT公司产品,按说明书操作。用SPSS12.0比较组间差异。结果从HBV携带者、慢性肝病、肝硬化到肝癌,血浆Hcy水平不断增加,以肝硬化和肝癌最为明显,分别为（8.84±2.74）,（11.83±3.39）,（14.46±3.51）,（16.78±4. 40）μmol /L,除HBV携带者、慢性肝病外其他各组血浆t-Hcy水平均高于健康对照组（p=0.008肝硬化,p=0.000肝癌）;根据HBV感染状态分组分析结果显示:HBV感染相关的肝硬化、肝癌患者血t-Hcy水平明显高于相应非HBV感染患者（p=0.023肝硬化,p=0.003肝癌）;根据抑癌基因甲基化状态分组结果显示:抑癌基因甲基化阳性的肝硬化、肝癌患者t-Hcy水平也明显高于甲基化阴性的相应患者（p=0.004肝硬化,p=0.000肝癌）。结论从HBV携带者、慢性肝病、肝硬化到肝癌,随着疾病严重程度的加剧,血中hcy水平呈逐步升高趋势;并且hcy水平升高与抑癌基因异常甲基化和HBV感染有一定关系。说明HBV感染和基因异常甲基化可能引起血浆t-Hcy升高,hcy在慢性肝脏疾病的发病机制中起一定作用,血中hcy的检测可以作为反映肝脏功能和疾病进展趋势的一项辅助指标。