目前,器官移植已经成为治疗各种脏器终末期疾病的唯一、有效治疗手段。许多患者通过移植同种异体器官获得新生。然而,外来器官进入机体后不可避免地会激发受者的免疫系统,产生针对移植器官的免疫应答以及排斥反应。多种新型免疫抑制剂的临床应用,虽然降低了移植排斥反应的发生率,但仍然存在两大问题：其一,免疫抑制剂并不能完全抑制排斥反应的发生；其二,长期应用免疫抑制剂存在诸多不良反应,包括药物的毒性、过度抑制机体免疫力造成的感染及新生肿瘤等。因此,抑制同种移植排斥反应并诱导机体对供者抗原的特异性免疫耐受,使机体保持正常的免疫力以抵抗微生物等病原体感染及肿瘤的发生,是解决器官移植排斥反应的最佳途径,也是移植领域研究的热点之一树突状细胞(dendritic cells, DC)是一类功能强大,并且是唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞,在识别和提呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重要的作用。然而,近年来的研究表明DC是一类异质性细胞群体,具有不同的亚群和不同的功能状态,不但在增强免疫反应上具有重要的作用,也具有抑制排斥反应、诱导特异性免疫耐受的潜力。有研究表明,未成熟DC缺乏共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达,体外能够诱导同种抗原特异性的T细胞失能。然而,体内未成熟DC存在着自然发育成熟的内在机制,同时,器官移植术后受者体内产生的多种介质,如致炎性细胞因子、LPS等,均能促进DC分化成熟,使之拥有强大的免疫原性。因此,某些体外调控手段,如免疫抑制分子1,25-二羟维生素D共培养或白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等基因修饰,可以使DC维持于稳定的不成熟状态,增强其耐受原性,是减轻移植排斥反应、诱导特异性免疫耐受的重要途径并具有潜在的临床应用价值。细胞因子信号抑制因子1(suppressor of cytokine signalingl, SOCS1)作为负性调节细胞因子Janus激酶-信号传导和转录活化因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信号途径的蛋白而被发现,可以抑制γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、IL-6、生长激素(growth hormone, GH)等细胞内信号传导。新的研究显示SOCS1对DC的成熟和功能具有重要的调控作用,源于SOCS1-/-小鼠的脾脏DC与正常DC相比,表达高水平共刺激分子,对IL-4、IFN-γ刺激呈明显高反应,刺激B细胞的增殖作用更加强烈。负载抗原的SOCS1-/-DC和正常DC分别注射到同一只小鼠不同足垫,前者能够激发小鼠足垫区域引流淋巴结更加强烈的Thl型反应,该淋巴结分离的T细胞能够产生更高水平的IFN-γ。SOCS1基因沉默的DC负载卵白蛋白(ovalbumin, OVA)后,体内、外均能更有效地刺激OVA特异性T细胞的增殖反应及细胞毒性作用。SOCS1基因沉默DC以及SOCS1-/-DC具有更强的免疫刺激功能以及打破自身耐受的能力。鉴于SOCS1基因对DC发育及免疫功能的重要调控作用,我们设想采用基因转染技术体外增加未成熟DC内SOCS1基因的表达将会减缓或阻止DC的成熟过程,体内回输有利于减轻排斥反应,并可能诱导稳定、有效的供者特异性免疫耐受。本文通过体外培养、扩增并富集小鼠骨髓来源的DC,并借助复制缺陷型腺病毒载体将SOCS1基因转入DC,研究SOCS1基因修饰的未成熟DC的表型及功能的变化以及体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性的作用和效果；通过建立小鼠同种异体异位心脏移植模型,观察SOCS1基因修饰的未成熟DC体内减轻排斥反应、诱导心脏移植免疫耐受的效果,并探讨了可能的机制。第一部分小鼠骨髓树突状细胞体外培养及SOCS1基因转染DC起源于骨髓,在体内分布广泛,但含量极少,不足外周血单核细胞的1%。体外培养DC可以为基础科研和临床治疗提供丰富的DC来源。我们采用重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage cell clone stimulate factor, rmGM-CSF)和rmIL-4共同刺激新鲜分离的小鼠骨髓细胞,培养小鼠骨髓来源DC,并根据小鼠骨髓来源DC高表达相对特异性表面分子CD11c,采用针对CD11c免疫磁珠分离法进一步富集DC。结果显示,刚制备的骨髓细胞极少有成簇或有树枝状突起的细胞,培养3天后有的散在克隆形成,带树枝状突起的细胞逐渐增多,培养5天后克隆较多,细胞的突起逐渐明显,成典型的未成熟DC表现。经免疫磁珠分离富集后,可以得到足够数量的DC,其纯度可以高达93%以上。腺病毒载体具有基因组结构简单、病毒滴度高、感染效率高、宿主细胞范围广、无插入突变等优势,因此我们构建了编码SOCS1基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-SOCS1), PCR、特异性酶切、测序鉴定以及Western Blotting等方法的检测结果已经证实,Ad-SOCS1载体构建成功,可以表达SOCS1蛋白。经过病毒扩增和滴度的检测,可以获得较高滴度的Ad-SOCS1载体。收获富集后的DC,按复合感染指数(MOI)1：100加入Ad-SOCS1或Ad-GFP病毒,未经病毒转染的未成熟DC作为对照。将上述三种细胞分别称为DC-SOCS1、DC-GFP、imDC(未成熟DC)。流式细胞仪分析DC-GFP组对照病毒载体转染效率；荧光实时定量PCR及Western Blotting检测各组DC内SOCS1基因的mRNA和蛋白表达。结果显示对照病毒载体Ad-GFP的转染效率可以达到70%以上；与imDC组及DC-GFP组相比,DC-SOCS1组SOCS1mRNA和蛋白表达水平明显升高(p<0.01)。上述结果表明我们构建的Ad-SOCS1载体能够有效转染DC,并明显上调DC内SOCS1基因的表达。第二部分SOCS1基因修饰的树突状细胞的表型特征及体外免疫学功能分析本部分实验,我们利用Ad-SOCS1腺病毒载体转染富集后的骨髓来源DC,观察了SOCS1基因修饰的DC的表型特征,并进一步研究其体外免疫学功能。采用rmGM-CSF及rmIL-4体外培养法扩增C57BL/6小鼠骨髓来源的DC,于培养第5天采用免疫磁珠分离法富集DC。通过Ad-SOCS1腺病毒载体将SOCS1基因转染DC,同时设Ad-GFP转染的DC及同期培养的未成熟DC作为对照组。分析脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激前、后DC的表型、细胞因子分泌、抗原吞噬以及抗原提呈能力的变化；SOCS1基因修饰的DC与同种BALB/c小鼠的CD4+T细胞混合淋巴反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)后,检测同种CD4+T细胞的增殖能力,培养上清中Thl或Th2来源的细胞因子水平以及IL-10分泌性T细胞的产生；同时观察SOCS1基因修饰的DC在二次同种MLR中,对诱导抗原特异性T细胞低反应性的影响。分析各组DC表型发现,DC-SOCS1与imDC在LPS刺激前,CD40、CD8o及MHC分子的表达无明显的差异,但SOCS1基因修饰可明显抑制LPS刺激对DC的表面上述分子表达的上调作用；检测细胞培养液上清内细胞因子水平发现,LPS刺激前各组DC分泌的IL-12无明显差异(p>0.05),但LPS刺激后DC-SOCS1分泌IL-12较imDC及DC-GFP明显降低(p<0.01),而DC-SOCS1分泌IL-10水平在LPS刺激前或后均较imDC或DC-GFP明显升高(p<0.01)。上述结果表明通过基因转染技术增加未成熟DC内SOCS1表达,可阻断外源性LPS对DC的成熟刺激作用,使之维持在稳定的未成熟状态。通过FITC-Dextran吞噬实验检测各组DC的抗原吞噬功能,发现LPS刺激前各组DC均具有较强的吞噬能力,LPS刺激后,imDC及DC-GFP的吞噬能力明显降低,DC-SOCS1的吞噬能力仅有轻度下降；进一步检测各组DC的抗原提呈功能,发现DC-SOCS1抗原提呈能力明显低于imDC和DC-GFP组(p<0.01)。上述结果表明SOCS1基因修饰可以使DC维持较强的抗原吞噬能力并抑制DC抗原提呈功能。通过MLR分析各组DC的免疫刺激活性,发现SOCS1基因修饰的DC刺激同种CD4+T细胞增殖的能力明显减弱(p<0.01)；检测同种MLR反应体系上清中细胞因子水平,发现DC-SOCS1组Thl型的细胞因子IFN-γ水平明显降低(p<0.01),Th2亚群的细胞因子IL-10水平明显升高(p<0.01);进一步行细胞内细胞因子染色,结果表明DC-SOCS1刺激的同种CD4+T细胞,细胞内IL-10表达水平明显升高。上述结果表明,SOCS1基因修饰的DC,免疫刺激功能明显降低,可抑制Thl亚群的分化,促进免疫反应向Th2偏移,并促进IL-10分泌性T细胞的产生,能够诱导同种T细胞低反应。进一步研究SOCS1基因修饰的DC体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性。在初次MLR中接受C57BL/6来源的DC-SOCS1刺激的BALB/c脾脏CD4+T细胞,在二次MLR中再次接触同种抗原时,表现出明显较低的反应性(p<0.01);在接触无关第三者抗原时,仍然具有与其他组类似的刺激活性(p>0.05),表明SOCS1基因修饰的DC诱导的T细胞低反应性具有同种抗原特异性。上述结果提示SOCS1基因修饰的DC免疫后有可能减轻移植排斥反应并诱导受者对同种移植器官的免疫耐受。第三部分SOCS1基因修饰的树突状细胞治疗同种移植排斥的效果和免疫学机制为进一步观察SOCS1基因修饰的DC体内环境下是否具有减轻移植排斥反应并诱导免疫耐受的作用,我们将C57BL/6小鼠来源的imDC、DC-GFP以及DC-SOCS1免疫BLALB/c小鼠后,采用同种小鼠颈部异位心脏移植模型,研究SOCS1基因修饰的DC体内治疗同种排斥反应、诱导免疫耐受的效果,并分析了可能的机制。将体重在20-22克、周龄相同的BALB/c小鼠,随机分成四组,每组8只,作为受者。在心脏移植术前第7天,3组BALB/c受者小鼠分别经静脉注入2×106个C57BL/6供者来源的imDC、DC-GFP或DC-SOCS1,并设经尾静脉注入等量PBS的BALB/c受者小鼠为PBS对照。四组受体小鼠分别于同一条件下接受C57BL/6供者心脏的颈部异位移植。另设姊妹组,在心脏移植后第7天及第15天处死受者小鼠,进行病理学及相关免疫指标分析。结果发现,imDC和DC-GFP组的心脏移植物存活期分别为10.9±1.4天和9.5±1.1天,较PBS组同种异体心脏移植物存活期7.1±0.9天均有所延长(P<0.01);DC-SOCS1免疫组的移植心脏存活期为25.5±6.9天,较imDC和DC-GFP组明显延长(P<0.01)。结果表明采用未成熟DC或对照基因修饰的DC免疫受体小鼠均可延长同种移植物存活期,但效果有限；采用SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,可以明显减轻移植排斥反应,在一定程度上诱导同种异体心脏移植物的免疫耐受,显著延长移植物的存活期(P<0.01)。组织学检查发现,PBS对照组移植心脏明显充血、肿胀,光镜下见心肌细胞明显变性、坏死,纤维断裂、间质水肿,肌束间及血管周围大量的炎性细胞浸润；imDC和DC-GFP组移植心脏仍有较明显的肿胀,光镜下见上述病变较PBS对照组有所减轻；DC-SOCS1组表现为心肌细胞无明显变性、水肿,血管周围仅有少量的淋巴细胞浸润。分析体内免疫学机制发现,imDC和DC-GFP免疫组受者小鼠的脾脏淋巴细胞对供者抗原刺激反应无明显区别(P>0.05),均较PBS同种移植组降低(P<0.01);而DC-SOCS1组与imDC和DC-GFP两组相比,脾脏淋巴细胞对供者抗原的刺激反应明显降低(P<0.01)。同时,DC-SOCS1免疫组受者小鼠的脾脏效应细胞在CTL反应中对靶细胞的杀伤活性明显减弱(P<0.01)。上述结果表明SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,其脾脏淋巴细胞对同种抗原的刺激呈低反应性,同时对同种抗原的杀伤活性亦明显降低。进一步分析各组受者小鼠脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg的产生,发现与PBS对照组相比,imDC和DC-GFP组受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg比例轻度增加(P<0.05); DC-SoCS1组与imDC和DC-GFP组相比,受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg比例明显增加(P<0.01)。荧光实时定量PCR检测的结果显示,DC-SOCS1组受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+T细胞内转录因子Foxp3的表达水平明显升高(P<0.01)。结果表明SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,可明显诱导体内CD4+CD25+Treg的产生并促进CD4+T细胞内Foxp3的表达。结论：重组复制缺欠型腺病毒载体介导的SOCS1基因转染可以明显增加DC内SOCS1表达,且病毒载体本身在转染过程中对DC的影响较小。即使存在外源性刺激物时,SOCS1基因修饰的未成熟DC仍然能够稳定于未成熟状态,表达低水平的MHC分子和共刺激分子,分泌高水平的免疫抑制性细胞因子IL-10,拥有较强抗原吞噬功能,较弱的抗原刺激能力,体外能够诱导同种T细胞抗原特异性低反应性。体内免疫SOCS1基因修饰的未成熟DC,能够抑制同种排斥反应,延长同种移植物存活期,抑制受体淋巴细胞的抗原反应性及CTL杀伤活性,诱导CD4+CD25+Treg的产生并促进Foxp3的表达,在一定程度上诱导受者形成免疫耐受。因此,进一步研究基于SOCS1基因修饰的DC的免疫治疗策略对于诱导移植免疫耐受有重要意义,具有潜在的临床应用价值