非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度致死性的病毒性传染病,给养殖业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将非洲猪瘟列为法定报告的动物疫病,在我国动物病原微生物名录中也列为一类动物疫病。由于缺乏针对ASFV的安全、有效的疫苗,因此建立快速准确的ASFV检测方法,对于该病的防控是极其重要的。p54蛋白是ASFV的重要结构蛋白,能引起机体产生明显的免疫反应,是ASFV血清学检测的理想靶点。抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的制备及p54蛋白B细胞表位的鉴定对ASF的诊断和监控具有重要意义。本研究将ASFV-China 2018 AnhuiXCGQ株的p54基因插入到慢病毒载体pLVX-IRES-Zs Green1和pTrip-IRES-puro中,构建了慢病毒载体pLVX-p54-IRES-Zs Green1（pLVX-p54）和pTrip-p54-IRES-puro（pTrip-p54）。pLVX-p54载体与慢病毒包装质粒ps PAX2和pMD2.G共转染HEK 293T细胞包装慢病毒,并用慢病毒转导H22细胞,转导后的H22细胞用流式细胞仪筛选高表达克隆,获得了稳定表达p54蛋白的H22细胞株,命名为p54-H22。pTrip-p54载体用同样的方法包装慢病毒并转导HEK 293T细胞,转导后的HEK 293T细胞用嘌呤霉素筛选有抗性的细胞并进行亚克隆,获得了稳定表达p54蛋白的HEK 293T细胞株,命名为p54-293T。以p54-H22细胞作为免疫原免疫Balb/c小鼠,用p54-293T细胞作为检测原,用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）检测和筛选阳性杂交瘤细胞,第三次免疫一周后小鼠血清IPMA效价可达1:25600。采用杂交瘤技术和IPMA筛选杂交瘤细胞株,用Western blot进一步验证这些单克隆抗体与p54蛋白的反应性,最终得到了8株能稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的细胞株,分别命名为4C2、4C6、4E3、5E6、5G11、10C2、16B11和21A2。利用生物信息学工具预测p54蛋白的B细胞表位区域,根据预测结果合成了10条涵盖p54蛋白胞外区和胞内区的重叠多肽（P1到P10）。多肽与ASFV阳性猪血清和免疫后小鼠血清的ELISA反应结果表明,多肽P3（54-75 aa）、P4（70-90 aa）、P6（93-115 aa）和P10（162-184 aa）是p54蛋白的免疫显性区域。多肽与抗p54单克隆抗体的ELISA和Dot-blot反应结果表明,多肽P3（54-75aa）被单克隆抗体4C2、4C6、4E3、5E6、5G11和10C2识别,多肽P4（70-90aa）被单克隆抗体21A2识别,多肽P6（93-115 aa）被单克隆抗体16B11识别。通过将P3、P4、P6多肽进一步截短后与单克隆抗体反应,将表位定位在64EEDIQFI70、75DQQWVEVTPQP85和103TGRPATNRPATNK115。其中,75DQQWVEVTPQP85是首次报道的p54蛋白的B细胞表位。本研究用表达ASFV p54蛋白的H22细胞免疫小鼠,制备了8株抗p54蛋白的单克隆抗体并鉴定了p54蛋白的线性B细胞表位。本研究制备的单克隆抗体和鉴定的表位为ASFV检测方法的建立提供了基础。