研究背景骨折是临床最为常见的骨骼肌肉系统的伤害之一,每年大约影响着2%的人口,而在所有骨折中5～10%的病例会出现骨折愈合障碍。随着社会的老龄化及各种因素导致骨折延迟愈合或不愈合的病例逐年增多,给个人、家庭及社会医疗资源均带来沉重的负担。目前骨折延迟愈合及不愈合的治疗手段,无论是自体骨移植手术还是BMP蛋白干预,均由于其自身的局限性而难以满足实际的临床需求,而且在临床上推广应用这些复杂、昂贵而带有潜在安全性问题的治疗策略的前景并不明朗。因此,临床现实情况始终迫切的需求一种简单、安全且又有效的治疗骨折延迟愈合或不愈合的非侵入式治疗策略。本课题组前期研究表明传统中药丹参的水溶性成分单体丹参素对于骨质疏松的治疗有良好疗效,而以往的中医治疗和研究均有在骨折治疗中应用丹参有效成分的先例,且本课题组己进行前期研究证明丹参素对骨缺损的治疗有良好效果。因此,本课题设想丹参素可用于治疗骨折愈合障碍。然而,由于丹参素自身存在易氧化、半衰期短等问题,加之骨组织具有硬度大、血流量低、渗透性差等生理学特殊性,丹参素并不适合直接以原型药用于骨折相关病症的治疗。现实的要求需要将丹参素开发成一种合适的药物剂型使其可稳定长效的在骨折部位发挥作用。目前发展纳米靶向药物已经广泛被认为是一项潜在的有良好前景的方向。纳米微粒靶向传递能够为潜在的骨折愈合障碍治疗提供许多独特的优势,包括可携带药物到其目的地的同时保持药物的浓度,最大化的发挥药物的作用,减少药物的副作用;保护药物不被体液所分散和降解,提高药物在体内的循环时间或滞留时间等。在各种纳米微粒靶向传递系统中,脂质体是一种制备简单、无毒、无免疫原性、易携载和释放各种药物、可经修饰将目的药物递达特定部位的理想纳米颗粒载体。因此,本课题研究选择丹参素为基础药物分子,以脂质体为药物载体,加入适当的骨靶向导向物,以期研发出一种丹参素纳米骨靶向脂质体用于治疗骨折愈合障碍,为中药小分子药物在骨骼相关疾病的开发和应用提供新的思路和实验依据,为发展现代创新的小分子天然药物提供参考依据。研究目标1.建立丹参素骨靶向脂质体的标准制备方法并对其基本性质进行表征;2.探讨丹参素骨靶向脂质体在体外和体内的骨靶向特性;3.探究丹参素骨靶向脂质体对糖皮质激素导致的小鼠骨折延迟愈合的疗效。研究内容1.丹参素骨靶向脂质体的制备及表征建立丹参素骨靶向脂质体的制备、纯化及分析检测的方法,表征丹参素骨靶向脂质体的基本特性,建立标准化制备操作,为下一步探讨骨靶向脂质体的骨靶向特性及体内药效学作用做好准备。1.1使用天然软磷脂、胆固醇按照一定比例以逆向蒸发法制备脂质体。在脂质体制备过程中,加入骨靶向导向物及丹参素溶液,骨靶向导向物嵌入到脂质体膜以及丹参素溶液被脂质体包裹成为丹参素骨靶向脂质体。利用Avanti迷你挤压器控制脂质体粒径大小以及用柱层析除去游离丹参素,纯化脂质体。1.2使用动态光散射粒度检测仪(DLS)测定制备的丹参素骨靶向脂质体的粒径大小及其膜表面电荷的大小,对其物理性质进行表征,利用透射电子显微镜(TEM)观察其丹参素骨靶向脂质体的结构特征。1.3使用高效液相色谱(HPLC)测定系列梯度的丹参素溶液,根据丹参素浓度与HPLC紫外吸收峰面积线性相关,建立丹参素的标准曲线,再使用快速蛋白液相色谱(FPLC)对制备的丹参素骨靶向脂质体进行脂质体与游离药物的分离,最后通过HPLC测定游离药物的浓度从而计算得到丹参素骨靶向脂质体的包封率。另一方面同样采用FPLC建立丹参素标准曲线,在使用FPLC分离脂质体和游离药物的同时,测定测定游离药物的浓度从而以另一种方法计算包封率。1.4使用DLS对已制备的丹参素骨靶向脂质体进行稳定性跟踪测试,分别在第1,3,8,15,30,45天测定制备脂质体粒径大小,验证丹参素骨靶向脂质体的稳定性。2.探讨丹参素骨靶向脂质体在体外和体内的骨靶向特性2.1使用罗丹明B对骨靶向脂质体进行荧光标记,进而进行羟基磷灰石吸附实验直接观察羟基磷灰石所粘附的荧光脂质体和测定吸附实验后的上清液的荧光密度,以直接和间接的方式表征骨靶向脂质体对羟基磷灰石的亲和力。另外使用异硫氰酸荧光素(FITC)对脂质体膜进行荧光标记,同样进行羟基磷灰石吸附实验,与罗丹明B荧光标记的脂质体实验相互验证。2.2使用罗丹明B对骨靶向脂质体进行荧光标记,局部注射到小鼠股骨表面(小鼠提前三天皮下注射钙黄绿素,对体内骨形成进行荧光标记),取股骨及胫骨进行冰冻切片以观察骨靶向脂质体在骨内的分布及其对骨组织的亲和力。另外使用FITC对脂质体膜进行荧光标记,进行同样实验(小鼠提前注射二甲酚橙,对体内骨形成进行荧光标记),与罗丹明B荧光标记的脂质体实验相互验证。2.3使用近红外荧光分子IRdye 800CW对骨靶向脂质体标记,局部注射到小鼠股骨骨折部位,采用小动物荧光成像系统观察记录骨靶向脂质体在体内骨折处的滞留时间及其分布。另一方面,制备骨靶向导向物含量不同的骨靶向脂质体,以脂质体在骨折处的滞留时间及在小鼠体内的分布为指标,比较骨靶向导向物含量不同对骨靶向脂质体性能的影响。3.探究丹参素骨靶向脂质体对糖皮质激素导致的小鼠骨折延迟愈合的疗效3.1采用高、中、低(6 mg/kg、9 mg/kg和12 mg/kg)泼尼松剂量对小鼠给药12周加上对小鼠实施闭合性骨折手术的方法,探讨糖皮质激素(GC)导致的小鼠骨折延迟愈合模型,筛选泼尼松诱导小鼠骨折延迟愈合的最佳给药剂量。实验过程使用小动物X射线成像系统跟踪观察并记录小鼠骨折愈合过程及骨痂变化情况。3.2制备高、中、低三个剂量(等量丹参素分别为5mg/kg/w、2.5mg/kg/w和1.25 mg/kg/w)的丹参素骨靶向脂质体,在小鼠实施闭合性股骨骨折手术后局部注射于骨折部位,探讨丹参素骨靶向脂质体对小鼠骨折愈合的影响,使用小动物X射线成像系统和小动物显微CT分析数据确定丹参素骨靶向脂质体对骨折治疗的有效剂量。3.3采用上两步已筛选的泼尼松剂量及丹参素骨靶向脂质体剂量对使用糖皮质激素的骨折小鼠进行治疗实验,通过使用小动物X射线成像系统的影像跟踪和小动物显微CT分析小鼠骨折后骨痂的形成,利用三点弯曲生物力学测试小鼠骨折9周后的骨生物力学性能,探究丹参素骨靶向脂质体对使用糖皮质激素的骨折小鼠骨痂形成的影响以及对糖皮质激素导致的小鼠骨折延迟愈合的疗效。研究结果1.DLS检测结果显示制备的丹参素骨靶向脂质体平均粒径大小为153 nm,平均分散系数(PDI)为0.230,脂质体膜表面电荷为-33.1 mv。2.TEM观察结果显示丹参素骨靶向脂质体为大单室球状,大小比较均匀,外观较圆整,分散性好,测量多处视野中多处脂质体粒径得平均粒径为166 nm,与DLS测定结果相近。3.DLS跟踪测定丹参素骨靶向脂质体制备后置于4℃保存,于第1,3,8,15,30和45天测试脂质体粒径大小发现,脂质体放置45天期间,其外观,粒径大小及PDI均未发生明显改变,初步证实本研究制备的丹参素骨靶向脂质体基本性质稳定,不易发生聚集沉淀或变性。4.采用两种方法(1.HPLC联合FPLC,2.单独使用FPLC)分别计算丹参素骨靶向脂质体的包封率:方法1测定结果显示丹参素靶向脂质体的平均包封率为31.45%;方法2计算出丹参素脂质体的包封率为33.15%。两种方法测定结果相近。结果说明本研究中丹参素骨靶向脂质体制备工艺及包封率稳定。5.采用罗丹明B荧光标记的骨靶向脂质体与羟基磷灰石进行6小时吸附实验,吸附后测定上清液的荧光密度结果显示,骨靶向脂质体荧光密度较原液对照及非靶向脂质体均明显下降,间接提示部分骨靶向脂质体对轻基磷灰石具有良好的亲和力。将沉淀的羟基磷灰石置于荧光显微镜下观察可见,骨靶向脂质体显示明亮荧光而非靶向脂质体荧光不可见。采用FITC荧光标记的骨靶向脂质体进行同样的轻基磷灰石吸附实验也得到相似结果,两种荧光标记的羟基磷灰石吸附实验均提示制备的骨靶向脂质体对羟基磷灰石具有良好的亲和力。6.采用罗丹明B荧光标记的骨靶向脂质体局部注射于小鼠股骨表面,24小时后取股骨进行冰冻切片观察,结果显示骨靶向脂质体可分布于骨生长板,骨小梁,皮质骨及骨陷窝等各类型骨中位点,与钙黄绿素的荧光有部分重合。将使用FITC荧光标记骨靶向脂质体进行同样实验,结果同样显示骨靶向脂质体分布于骨生长板和皮质骨,与二甲酚橙的荧光有部分重合。体内骨组织吸附实验表明骨靶向脂质体可正常粘附于骨组织,且不仅局限与骨形成部位,可分布于骨内各个位点,具有良好的骨粘附性。7.采用IRdye 800CW荧光标记的骨靶向脂质体,局部注射于小鼠骨折部位,观察骨靶向脂质体在体内骨折部位的滞留时间及体内分布,结果显示骨靶向脂质体可集中分布于骨折部位,并不逸散到身体其他部位,并在骨折部位的滞留之间长达10～20天,其中添加2 × 10-6M骨靶向导向物的脂质体滞留时间为10天,添加4×10-6M骨靶向导向物的脂质体为20天,添加8×10-6M骨靶向导向物的脂质体为14天,而等量对照的非靶向脂质体注射完后脂质体逸散,全身分布,少量脂质体滞留在骨折部位至第8天,同时等量对照IRdye 800CW溶液注射后,第3天即完全代谢出体外。实验结果表明制备的骨靶向脂质体具备的良好的体内骨靶向性,可集中分布于骨折部位,作用长效,而且在骨折部位滞留的时间与骨靶向导向物的含量相关,但不是线性关系。8.不同剂量的糖皮质激素诱导小鼠股骨骨折延迟愈合实验,X射线影像结果显示,小鼠骨折后30天,正常对照组小鼠骨折愈合过程基本完成,骨痂消退,股骨恢复至正常形态;而糖皮质激素给药各组小鼠骨折处仍存有大量骨痂,表明糖皮质激素给药各组小鼠骨折延迟愈合。糖皮质激素低剂量组(6 mg/kg/d)小鼠,其骨折愈合时间比正常骨折小鼠延迟12天,骨折愈合时间增加40%;糖皮质激素中、高剂量组(9mg/kg/d,12mg/kg/d)小鼠,其骨折愈合时间较正常小鼠延迟至少34天,骨折愈合时间增加113%以上,提示小鼠骨折延迟愈合的程度与糖皮质激素剂量有关。9.丹参素骨靶向脂质体对骨折治疗的有效剂量筛选实验。X光影像跟踪观察结果显示小鼠实施闭合性股骨骨折手术后,高剂量丹参素骨靶向脂质体(等量丹参素5mg/kg/w)治疗组小鼠骨痂形成明显较对照组增多。显微CT对小鼠骨折部位骨痂的定量分析结果显示,高剂量丹参素骨靶向脂质体BV/TV明显较对照组显著增加17%,而其他剂量的丹参素骨靶向脂质体与对照组相比无统计学差异。使用显微CT对各组小鼠胫骨干骺端骨小梁分析结果提示,随着丹参素骨靶向脂质体剂量的提高,小鼠的胫骨骨小梁的体积百分率也随之增加。10.探究丹参素骨靶向脂质体对糖皮质激素导致骨折延迟愈合的疗效,X射线影像结果显示,骨折后18天,GC骨折模型组小鼠骨痂形成明显较正常骨折对照组减少,骨痂体积较小。而丹参素骨靶向脂质体治疗组,骨痂形成较GC模型组明显增多。使用显微CT对小鼠骨折处骨痂进行定量分析,结果显示GC模型组小鼠与对照组相比,骨折处骨痂体积百分数明显降低,而丹参素骨靶向脂质体对GC作用的骨折小鼠进行治疗,使小鼠骨痂体积百分数较GC模型组明显增加57%,显著促进使用糖皮质激素的骨折小鼠的骨痂形成;丹参素骨靶向脂质体的治疗能够将使用糖皮质激素骨折小鼠的愈合时间缩短22天以上,并显著改善小鼠骨折愈合后的骨生物力学性能。表明丹参素骨靶向脂质体可显著对抗糖皮质激素导致的小鼠骨折愈合延迟及骨生物力学的损害。研究结论本研究成功制备一种丹参素骨靶向脂质体并对其各项基本性质进行了表征。实验结果显示丹参素骨靶向脂质体性质稳定,包封率较高,具备良好的骨靶向性,可在正常小鼠骨折模型及糖皮质激素导致的骨折延迟愈合小鼠模型上促进骨痂生长,缩短使用糖皮质激素的小鼠的骨折愈合时间,并显著改善骨折后的骨生物力学性能,是一种潜在的有希望被开发为临床上用于治疗骨折愈合障碍的天然小分子创新药物。